[发明专利]猪瘟活疫苗的制备方法及其产品

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽用活疫苗的生产方法，尤其涉及一种猪瘟活疫苗的制备方法以及由该制备方法得到的产品，属于猪瘟活疫苗的生产领域。

背景技术

猪瘟(Hog cholera，HC)是由猪瘟病毒引起的一种高度接触传染性疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疾病名录，为法定必需报告的传染病。在我国，猪瘟是重大疫病之一，在《一、二、三类动物疫病病种名录》中将猪瘟列入一类17种动物疫病之一，猪瘟的爆发流行给世界和我国的养猪业造成严重经济损失。

疫苗是控制猪瘟的重要手段，包括灭活疫苗和弱毒疫苗。各国都在努力研究安全有效的疫苗。经过多年应用，公认安全有效，没有残余致病力的弱毒疫苗株有三种：①中国兔化弱毒疫苗；②日本GPE细胞弱毒疫苗；③法国“Thiveosal”冷变异弱毒株。其中中国学者研制成功的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在我国广泛应用外，并已推广到欧亚很多国家，使这些国家控制或消灭了猪瘟。该疫苗被公认为目前世界上比较理想的猪瘟疫苗。

将猪瘟兔化弱毒接种于犊牛睾丸细胞制备而成的猪瘟细胞苗，具有生产成本低，便于工厂化生产，不良反应少等优点，缺点是用牛睾丸细胞培养猪瘟兔化弱毒(HCLV)，毒价不稳定，批间差异很大，兔检合格的产品，最高和最低毒价相差甚远，且生产过程中使用牛睾丸、牛血清，有污染牛病毒性腹泻病毒的可能性，引起免疫失败。

疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标，HCLV在细胞中的增殖力较弱，不产生致细胞病变，对其效价的测定一直沿用兔体定型热反应法(兔热法)。但该法存在的突出不足是：兔热法测毒属于一种非特异性反应，用其测毒不能准确定量，测毒结果易受兔体个体差异和天气条件影响，试验周期长、费时费力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服猪瘟细胞苗的生产所存在的不足，提供一种新的猪瘟活疫苗的制备方法，该方法能够快速、准确的测定疫苗效价，所制备的疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种猪瘟活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)、培养猪源传代细胞系；(2)、将猪瘟活疫苗生产种毒接种猪源传代细胞系，筛选得到猪瘟弱毒疫苗株；(3)、将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖；(4)、采用免疫荧光方法测定增殖病毒悬液的(TCID₅₀)毒价；(5)、向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，即得。

本发明针对猪瘟细胞苗在生产中所存在的一系列问题，从经过如下几个阶段进行改进：(1)、猪源传代细胞系的筛选与鉴定：将猪瘟兔化弱毒接种不同猪源传代细胞系，至37℃培养4～5日，收获病毒，将收获病毒传代，应用免疫荧光方法对接种不同猪源传代细胞系的各代次病毒进行检测，检测结果显示猪瘟兔化弱毒可在PT细胞系，MPK细胞系，SK6细胞系，PK 2a细胞系，CPK细胞系或RKC细胞系上增殖。(2)、毒种的制备：将猪瘟兔化弱毒在PT细胞系上进行传代，适应PT细胞系。应用有限稀释法进行两轮克隆纯化，筛选到一株合适的猪源传代细胞系的猪瘟弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3891；分类命名是：猪瘟病毒；保藏时间是：2010年5月27日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(3)免疫荧光方法的建立：应用抗CSFV单克隆抗体建立免疫荧光方法，应用此方法进行病毒TCID₅₀的测定。

优选的，步骤(1)所述的猪源传代细胞系的培养方式为单层贴壁培养、悬浮培养或固定化培养。

步骤(2)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量(MOI)0.1-0.5接种到PT单层细胞系上进行培养，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过5次。

步骤(4)中采用免疫荧光方法测定增殖病毒的(TCID₅₀)毒价时，所采用的单克隆抗体优选为抗CSFV单克隆抗体(北京健翔和牧生物科技有限公司对外有售)，所采用的标记物优选为FITC或IPMA；所用到的固定液优选为预冷的80％丙酮、10％甲醛或75％乙醇。更优选的，所述的免疫荧光方法包括以下步骤：

(1)细胞传代，准备细胞培养板：选取生长良好的PT细胞，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，应用台盼兰稀释计数，调整细胞密度为2.5～3.5×10⁵个/ml，以100ul/孔接入96孔细胞培养板。