[发明专利]一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

权利要求书

1.一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQIDNO.2所述。

3.一种权利要求1所述的来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤：

（1）总RNA的提取和纯化：

采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫状卷柏叶片总RNA；

（2）中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod(T)18：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3’为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增：

jf1:5’-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3’，

jx1:5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’；

扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列；

（3）3’端的克隆：

以前述步骤（2）A中得到的cDNA第一链为模板，利用下述上游引物S1和下游引物AP2进行PCR扩增：

S1: 5’-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’，

AP2:5’-TACGTACGGCATGACAGTG-3’；

扩增得到完整的3’端，通过克隆测序，得到3’端序列；

（4）、5’端的克隆：

C、合成5’端的cDNA第一链：

以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述下游引物jx1和上游引物SMARTIIAOligo为反转录引物，进行反转录：

jx1:5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’，

SMARTIIAOligo:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’；

合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链；

D、第一段PCR扩增：

以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A2和同源上游引物C1，进行5’端第一段PCR扩增：

A2:5’-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3’，

C1：5’-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3’；

扩增得到的产物为cDNA5’端第一段，通过克隆测序，得到5’端第一段的序列；

E、第二段PCR扩增：

以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A5和上游引物P3，进行5’端第二段PCR扩增；

A5:5’-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’，

P3:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

扩增得到的产物为cDNA5’端第二段，通过克隆测序，得到5’端第二段序列；

（5）ORF的克隆和拼接：

将上述步骤（2）所得中间片段序列、步骤（3）所得3’端序列、和步骤（4）所得5’端第一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板；

以下述上游引物ORF4和下游引物ORF5进行PCR扩增：

ORF4：5’-CCCAAGCTT(HindⅢ)CCTCGAG(XhoⅠ)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC-3’，

ORF5:5’-CGCGGATCC(BamHⅠ)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3’；

扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。

4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，采用的RNA提取方法为Trizol法；纯化方法为DNA酶消化法。