[发明专利]一种囊膜病毒的生物素标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学、病毒学以及生物科学等领域，具体涉及一种囊膜病毒的生物素的标记方法。

背景技术

近年来病毒的角色正悄悄地发生变化，从谈虎色变到人类认识和改造自然的重要工具。作为自然界最原始的生物物种，病毒的应用领域却不断延伸。由于病毒具有较小的尺寸且在纳米尺度，结构对称，可遗传操作并在水相中具有良好的分散性等诸多特性，广泛应用于从材料科学到生物医药等领域。材料领域中，科学家常常利用病毒独特的对称结构，以各种功能化的病毒或病毒蛋白为基底构建具有独特结构的多功能纳米材料。医学及生命科学领域中，病毒(腺病毒等)由于其较高的转染效率已经被广泛用作基因载体和转基因药物。而在病毒学中，带有各种标记的病毒常常用于病毒的纯化，病毒与宿主相互作用等研究。随着病毒应用领域的快速延伸，这就需要我们能够根据不同领域各自不同的需求来对病毒进行功能改造。生物素和亲和素，由于它们极强的结合能力并能和多种功能分子(如DNA，抗体，多肽，量子点等)进行偶联已经广泛用于病毒的功能化，其应用范围已经涉及基因治疗，病毒纯化，肿瘤治疗，生物传感及病毒示踪等领域。

目前有三种方法可以实现病毒的生物素化：1，直接化学偶联--主要针对病毒表面的氨基和羧基等活性功能基团。2，疏水相互作用--主要针对病毒囊膜。3，遗传工程方法--主要针对病毒的膜蛋白。虽然这些方法已经在各个领域中广泛应用，但是它们的操作过程往往十分复杂，技术难度大特别是容易在病毒的偶联和随后的纯化中导致病毒活性的丧失，这些都不利于其进一步的应用。尤其是对于囊膜病毒，其囊膜结构十分容易被破坏，这就迫切需要我们找到一种快速有效的生物素标记囊膜病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术不足提供一种适用于囊膜病毒生物素标记的方法。

本发明囊膜病毒的生物素标记方法，是用经生物素化的细胞培养囊膜病毒。其利用囊膜病毒使用宿主细胞的膜系统来装配病毒囊膜的特性实现生物素化的磷脂在病毒囊膜上的标记。

囊膜病毒的表面被一层由磷脂双层分子及其镶嵌其间的各种蛋白构成的膜结构覆盖，其作用主要是帮助病毒通过膜融合侵入宿主细胞。和所有的普通病毒一样，囊膜病毒也是在宿主细胞中完成自我复制和装配，其囊膜是来源于宿主细胞的细胞膜和内膜系统。基于囊膜病毒的这一特点，首先将细胞生物素化，然后利用这种已经生物素化的细胞培养囊膜病毒，就可以得到生物素标记的病毒。

上述生物素化的细胞可以通过将细胞在添加有磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物(Biotin Cap phosphatidylethanolamine，Biotin Cap PE，图1)的培养基中培养获得。利用磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物标记细胞，通过细胞膜运动可以实现生物素在各个细胞膜结构中的扩散和分配。所述生物素衍生位置为磷脂酰乙醇胺的亲水端。

上述生物素化的细胞为细胞膜或细胞内膜系统生物素化的细胞。所述囊膜病毒的囊膜来源于细胞膜或者细胞内膜系统。所述内膜系统包括但不限于高尔基体或内质网的膜系统。

本发明方法具体可包括如下步骤：

配制生物素化培养基：向细胞培养基中添加磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物；

用生物素化培养基培养病毒的宿主细胞，得到生物素化宿主细胞；

向生物素化宿主细胞中接种病毒；

待病毒的噬斑形成，细胞出现漂浮后，将病毒培养液收集；

用蔗糖梯度离心，纯化和浓缩病毒。

上述方法中，可在囊膜病毒的培养过程中继续添加磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物，以加强生物素标记效果。

磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物在细胞培养基中的添加量以不影响细胞生长为宜，实验表明即使在磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物饱和浓度下亦未产生明显的毒性。在本发明实施例中，磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物添加终浓度为0.02g/L。在囊膜病毒的培养过程，可以在维持液中添加适量浓度的磷脂酰乙醇胺的生物素衍生物，以到达加强标记效果的目的。

细胞的生物素化表征