[发明专利]生殖器疱疹重组腺病毒载体二价活疫苗的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗2型单纯疱疹病毒感染所致生殖器疱疹的新型重组腺病毒载体二价活疫苗。

背景技术

生殖器疱疹是仅次于艾滋病的病毒性性传播疾病，其病原体主要是2型单纯疱疹病毒，占原发感染的90％以上。II单纯疱疹病毒人类后主要引起生殖系统原发性和复发性疱疹，可以终生潜伏在神经节内，在机体感染免疫力降低时复发。孕妇感染HSV-II型病毒后易发生流产，也可致胎儿先天畸形或智力低下。新生儿在分娩时感染可导致高热、呼吸困难或中枢神经系统病变，其中60％-70％的新生儿可能死亡。此外，有研究表明，生殖器疱疹可将艾滋病感染风险增加2-3倍，并促进艾滋病病毒的传播。目前并无生殖器疱疹，尤其是复发性生殖器疱疹特效治疗方法，也有研究表明，安全套不能有效预防疱疹病毒感染，所以，世界范围内生殖器疱疹发病率逐年上升，美国最新统计数据显示，美国成人生殖器疱疹患病率已经上升到了25％，可以说每四个成人中就有一人罹患生殖器疱疹，因此迫切需要开发能有效防治生殖器疱疹的疫苗。

过去几十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；减毒活疫苗存在安全隐患，具有致癌风险；新型DNA疫苗虽能同时诱导体液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市。

近年来，病毒载体活疫苗逐渐引起了疫苗研究者的重视，其中的腺病毒载体更是以其独特的优势博得了研究者的青睐。首先，腺病毒载体的安全性已经在临床上得到了实践的检验，世界上有关腺病毒载体的临床实验达数百项，而中国已经有两种腺病毒载体抗肿瘤药物上市。其次，国内外诸多研究证明，腺病毒载体疫苗可以经粘膜途径免疫，可以模拟野生型病毒的感染过程，有效地诱导粘膜免疫和细胞免疫应答，是新型疫苗的优良载体。此外，腺病毒载体构建和生产工艺已经成熟，工业化生产不存在任何问题。

近年来的研究发现，HSV膜表面的糖蛋白B和糖蛋白D是其感染必需糖蛋白，在HSV的感染过程中发挥着根本性的作用，缺一不可，同时二者也是诱发免疫应答最强的两种糖蛋白，目前大多数疱疹亚单位糖蛋白疫苗都是选择这两种糖蛋白作为研究对象。目前一些DNA疫苗的研究发现细胞因子如白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等等可以起到免疫佐剂的作用，被称为是分子佐剂，可显著地增强疫苗的免疫效果。本发明利用现代分子生物学技术，首次制备了携带HSV-II型保护性抗原-糖蛋白D和糖蛋白B，同时能够表达分子佐剂IL-2的二价重组腺病毒载体活疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种可防治HSV-2感染所致生殖器疱疹的重组腺病毒载体二价活疫苗的制备及应用方法。

本发明涉及一种重组腺病毒载体二价活疫苗，由携带HSV-2糖蛋白B和糖蛋白D基因的全长序列的表达盒和携带细胞因子白介素2表达盒的重组腺病毒载体构成。具体来说就是通过同源重组将IL-2表达盒插入腺病毒载体质粒pAdeasy-1中，构建表达IL-2的腺病毒载体，再从野生型2型单纯疱疹病毒中用PCR技术将其糖蛋白B和糖蛋白D的全长序列扩增出来，再通过同源重组插入到表达IL-2的腺病毒载体中，疫苗质粒即构建成功，将疫苗质粒用PacI酶切后转化到293细胞中，待293细胞出现细胞病变效应时收获病毒即成功制备可防治生殖器疱疹的重组腺病毒载体二价活疫苗JSA01BD。

本发明用以构建重组腺病毒所需的质粒购自stragene公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录。

插入的糖蛋白B基因来源于野生型2型单纯疱疹病毒基因组的UL27基因的全部编码序列。

插入的糖蛋白D基因来源于野生型2型单纯疱疹病毒基因组的US6基因的全部编码序列。本发明中的IL-2是以genebank中的人类白介素2的参考序列为依据，经密码子优化后合成而得到的，由SV40启动子和PolyA共同构成IL-2表达盒。