[发明专利]一种制备丙酮丁醇梭菌固定化细胞的技术方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种微生物固定化细胞技术发酵应用方法，具体应用于丙酮丁醇乙醇等溶剂的发酵生产中，同时在酒精、啤酒和抗生素发酵中具有通用性。

背景技术：

随着固定化酶技术的日益成熟，固定化对象已有单纯的酶发展到了活细胞。利用固定化细胞发酵具有制备简单、不易感染杂菌、易保存、适应高稀释比，易实现连续生产和自动控制，生产效率高等优点。以前丙酮丁醇梭菌固定化细胞国内报道大多以吸附法为主(瓷环，CCS)。

发明内容：

以聚乙烯醇(PVA)为基体，利用包埋和交联相结合制成高分子复合材料。其方法：以PVA为基体，另加入一定比例的凝固剂、交联剂等几种物质。分别为甘油、硅藻土、磷酸二氢钾、硼砂1.5％、顺丁烯二酸酐、菌悬液和水。按一定的比例和添加顺序，迅速冷冻、切块制成一种高分子复合材料。该材料不管从强度、柔韧性、细胞的通透性等方面试验均为良好的发酵载体。

具体实施方式：

1.培养基制作：用市售玉米经磨粉，40目过筛后，配置成7％浓度的玉米粉溶液，100℃糊化冷却，总糖含量4.2-5.4％备用。

2.固定化载体制备：以聚乙烯醇(PVA)为基体，利用包埋和交联相结合制成高分子复合材料。

3.载体固定化方法：采用材料和配比为：聚乙烯醇8％(A)、甘油5％(B)、硅藻土1％(C)、磷酸二氢钾1％(D)、硼砂1.5％(E)、顺丁烯二酸酐1％(F)、菌悬液30％(G)、水50％(H)。添加顺序：A-B-E-F-C-D-H-G，迅速冷却切块保存或直接发酵。

4.发酵试验：

静止分批试验：1000ml三角瓶装入培养基750ml，接入10％的固定化细胞载体，38-42℃恒温静止培养45-72小时，取样测定溶液中丙酮含量和残糖。

更换培养基发酵：待静止发酵停止后，经测定溶液中丙酮含量不再增加、残糖不再降低时，换新的培养基。将原培养基中固定化细胞用无菌水洗涤，投入新培养基中重复使用，测丙酮含量及残糖，观察载体强度、细胞流失情况、细胞通透性等性状、多次重复以上步骤，直至载体深化，细胞流失完，不能再发酵。

5.分析方法(采用原发酵法溶剂生产厂通用测定方法)

丙酮含量测定：碘量法。

残糖测定：斐林氏法。

酸度测定：中和法。

6.实验现象和发酵结果

按以上顺序制做后，迅速冷却切块，投入料液。与游离细胞相比，实验现象为：接种后2h左右开始产气，即发酵开始较游离细胞快4h；整个发酵过程中从表面现象看，产气量较游细胞大，且溶液对对流急；达到酸峰的时间为10~15h，而游离细胞为18~24h；达到酸峰时酸度较游离细胞高0.5~1.0；从发酵速度看，较游离细胞快，即发酵周期短。发酵1个月后细胞流失量不明显。载体机械强度高，细胞的通透性比较明显。载体在整个发酵过程中都显示了良好的性能，如热稳定性等。但溶液中丙酮含量相对于游离细胞有所提高，残糖有所下降。

固定化细胞发酵结果表所示。