[发明专利]新城疫病毒Italien株辅助表达质粒系统和检测该系统的微型基因组及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，特别是构建新城疫病毒Italien株辅助表达质粒系统和检测该系统的微型基因组及其应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一种能引起家禽呼吸道感染等症状的负链RNA副粘病毒。NDV的RNA基因组全长约15kb，不分节，包含6个基因，分别编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)和RNA依赖的RNA聚合酶(large polymerase，L)。其中，NP、P和L蛋白与病毒基因组的复制和转录密切相关。病毒核衣壳主要由NP蛋白构成，其次也包含有一定数量的P和L蛋白，在病毒感染宿主细胞的过程中，NP、P和L蛋白与病毒基因组RNA一起形成核糖核酸蛋白复合物(RNP)，该复合物行使RNA依赖的RNA聚合酶的功能，负责病毒基因组RNA的转录和复制。

NDV基因组中除含有编码6种病毒蛋白的编码序列外，还包括位于编码序列上下游的启始序列(GS)、终止序列(GE)以及位于两者之间的中间序列(IG)。其中，GS和GE序列分别是病毒蛋白基因转录的起始和终止识别位点。而病毒基因组复制的调控序列和病毒RNP复合物的结合位点则位于病毒基因组5′和3′端初始的十几个到数十个碱基内，在GenBank公布的所有NDV毒株中，上述碱基尤其是初始的12个核苷酸序列高度保守。

目前NDV相关的的研究工作主要体现在两个方面：一方面，作为一种重要的禽类病毒，NDV可以引起家禽新城疫而对家禽养殖业造成重大损失，因此需要研究高效广谱的NDV疫苗；另一方面，NDV是一种天然的溶瘤病毒，具有天然的选择性在人体肿瘤细胞内复制并且最终杀死肿瘤细胞的特性，而对人体正常细胞和组织没有致病性，因此NDV被认为是一种潜在的抗肿瘤治疗制剂。人们期望可以通过对NDV进行重组改造，获得可以用于肿瘤临床治疗的重组NDV。

上述两个研究方向均涉及到运用反向遗传学技术对病毒进行体外重组和复活。NDV复活过程中，除需要病毒基因组本身以外，同时还需要构成RNP复合物的三个病毒蛋白共同作用，才能完成基因组的复制和转录，因此，构建NP、P和L基因的辅助表达质粒是复活过程中所必需的。

要明确NP、P和L三种基因的真核表达产物能否正确表达，以及能否正确组装成RNP复合物进而行使正常功能，则需要构建一个带有标签蛋白的病毒微型基因组进行功能验证。病毒微型基因组携带有病毒基因组两端的非编码区和调控序列，同时携带编码标签蛋白(如DsRed、荧光素酶等)的序列。通过检测标签蛋白的表达，可以验证与病毒基因组复制和转录相关的NP、P和L蛋白的功能，因此，病毒的微型基因组同时也是体外重组病毒复活过程中所需要的。同时，病毒微型基因组也可以作为研究病毒基因组调控序列和非编码序列在调控病毒蛋白表达中作用的一种研究工具。

发明内容

本发明的目的是为了获得两种不同转录启动子(CMV启动子和T7启动子)调控下的新城疫病毒强毒株Italien的NP、P和L三个基因的6种真核表达质粒系统，以及用于检测这三个基因表达产物功能的携带不同标签蛋白的NDV微型基因组及其应用。

本发明所采用的技术方案是：

通过网上数据库序列，设计可用于扩增NDV Italien毒株NP、P和L蛋白完整编码序列的引物。

通过网上数据库序列比对，确认NDV基因组3′和5′的保守区域，同时设计可用于NDVItalien毒株基因组3′和5′两侧的非编码区的扩增引物。

通过RT-PCR，采用上述引物扩增相应的片段，并且进行测序，确认相应的序列。

基于pcDNA3.1(+)真核表达质粒(CMV启动子)，将NP、P和L基因分别克隆进入相应位点并且进行真核瞬时表达，质粒分别命名为pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。其中NP基因表达质粒pcDNA-NP包含SEQ No 1的序列，其表达产物包含SEQ No 4的氨基酸序列，P基因表达质粒pcDNA-P包含SEQ No 2的序列，其表达产物包含SEQ No 5的氨基酸序列，L基因表达质粒pcDNA-L包含SEQ No 3的序列，其表达产物包含SEQ No 6的氨基酸序列，上述质粒在真核细胞中分别表达新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白。