[发明专利]一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取高纯度芝麻线粒体DNA(mtDNA)的方法。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum L.)古称胡麻，是我国继油菜、大豆和花生后的第四大油料作物，因其不仅含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质、钙、磷、铁等物质，还含有多种维生素和芝麻素(sesamin)、芝麻酚(sesamol)、甾醇及卵磷脂等营养元素(http://www.ars.usda.gov)，自古以来被誉为营养和保健食品，并可入药。我国是世界芝麻主产国之一，在全国多数省市均有种植，尤其以长江、淮河流域较为集中。芝麻每亩单产水平较低，据统计，印度25.27kg、缅甸23.44kg、苏丹12.19kg、中国69.82kg，除本身遗传因素外，病、虫、渍、旱等生物或非生物胁迫影响也是重要因素。

线粒体是植物进行呼吸的细胞器，其编码的一些线粒体呼吸链中的几个主要组成蛋白具有重要功能，存在一个线粒体基因表达与核基因表达的协调机制问题，这种协调机制直接关系到线粒体电子传递链的畅通，进而影响到氧化磷酸化作用。尽管大多数的线粒体蛋白是由核基因组编码，在细胞质中合成后再运入线粒体中的，但线粒体基因组仍包含有10％左右的形成线粒体的遗传信息，特别是翻译体系中的rRNA和tRNA组分也是由线粒体DNA编码。研究表明，细胞质雄性不育、抗除草剂、抗逆等性状与线粒体DNA(mtDNA)有关(HansonMR，et al.，2004；罗银玲等，2004；向文胜等，1997)，因此研究线粒体基因具有重要意义。

植物线粒体DNA(mtDNA)的提取方法主要有密度梯度离心法(Mikami T，et al.，1984；Leroy P，et al.，1985；唐群等，2005)和差速离心法(Pring DR and Levings CS，1978；Kemble RJ，et al.，1980；McNay JW，et al.，1984；Wilson AJ and Chourey PS，1984；Kemble RJ，1987；Pérez C，et al.，1990；Triboush SO，et al.，1998；Scotti N，et al.，2001)等方法。密度梯度离心法得到的mtDNA纯度高，但操作复杂、耗时，对材料的需求量大，且mtDNA提取产量低，长时间高速离心对离心机要求很高。差速离心法因其操作简单，是目前应用最多的方法，但所提取的mtDNA纯度低、易降解，且易受核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染，所以要在差速离心的基础上添加其他一些辅助步骤，以获得高纯度线粒体DNA。

差速离心提取线粒体DNA法一般包括材料获取、匀浆化处理、过滤、差速离心获得粗制线粒体、DNase处理、衬垫离心获得较纯的线粒体以及线粒体裂解获得线粒体DNA等步骤。材料获取大多选择黑暗培养获得的黄化苗，这样提取获得的线粒体可以最大程度的减小叶绿体的污染，但也有人选择特定的植物组织作为提取材料；匀浆化处理一般是在预冷研钵中添加匀浆缓冲液及材料研磨获得匀浆，这样获得的完整线粒体所占比率大，但是由于研磨的不够充分，获得线粒体量较少，后来研究者纷纷尝试机械匀浆的方法，机械匀浆虽然线粒体碎片较多，但是经过后续的辅助步骤仍可以获得高纯度的线粒体，因该技术操作简便、线粒体提取效率高，已经被广泛利用；由于不同作物线粒体大小及重量不一，所以不同作物提取线粒体所需离心速率也不一样，但一般都是先以1000～3000g的转速除去细胞核及其他杂质，然后再以12000～17000g的转速获得粗制线粒体；DNase处理步骤，不同作物所用的DNase浓度不一，但一般都是在4℃条件下处理1h，但也有些研究者在室温和37℃条件下处理；衬垫离心一般选用0.2～0.6M蔗糖衬垫进行低温高速离心；获得的线粒体一般用SDS结合蛋白酶K在37℃裂解，再经过氯仿抽提而获得线粒体DNA(mtDNA)，但也有人使用十二烷基肌氨酸钠结合蛋白酶K和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)结合蛋白酶K裂解获得mtDNA。