[发明专利]一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法

权利要求书

1.一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)材料的预处理：将芝麻种子置于恒温培养箱中28～30℃黑暗培养，得到黄化苗；

(2)匀浆化处理：准确称取步骤(1)获得的黄化苗，加入预冷的研磨缓冲液，用匀浆器快速匀浆，再在冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎，100～200目过滤，得到过滤液；

(3)离心获得粗制线粒体：将步骤(2)得到的过滤液于2～6℃，2200～2600g离心12～15min，然后将离心得到的上层清液于2～6℃，12000～13000g离心10～12min，收集粗制线粒体沉淀；

(4)Dnase处理：在步骤(3)得到的粗制线粒体沉淀中，加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入DNase I，2～6℃酶解1.4h～1.6h，得到酶解液；终止酶解反应；再将终止酶解反应后的溶液叠加在洗涤缓冲液中，于2～6℃，15000～20000g离心12～15min，收集沉淀；

(5)裂解获得线粒体DNA：在步骤(4)获得的沉淀中，加入悬浮缓冲液，混匀，于2～6℃，12000～13800g离心12～15min，去除上清液，然后向得到的沉淀中加入裂解缓冲液，再分别加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)，37℃水浴2h以上，得到线粒体裂解液；

(6)抽提提纯：步骤(5)的线粒体裂解液平衡至室温后，向其中加入NH₄Ac至终浓度为0.8mol/L，然后加入苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，于2～6℃，12000～13800g离心12～15min，分离出上层溶液；以上层溶液的体积为基准，分别向上层溶液中加入1/10体积的浓度为8mol/L的NH₄Ac和2.5～3倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃沉淀，然后于2～6℃，12000～13800g离心10～15min，收集线粒体DNA沉淀；

(7)Rnase处理：用70％的乙醇(重量百分数)将步骤(6)的沉淀洗涤至少3次，在空气气氛中干燥，然后用含20μg/ml RNase的1×TE溶解，置于-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述研磨缓冲液：500mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.1％(体积百分数)牛血清蛋白，5mmol beta-巯基乙醇，pH为7.5；所述悬浮缓冲液：0.5mmol/L蔗糖，50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgCl₂，pH为7.5；所述洗涤缓冲液：600mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，20mmol/l EDTA，pH为7.5；所述裂解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

3.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中：培养时间为6～8天，得到的黄化苗高度为5±3cm。

4.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中：研磨缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加3～5mL；超声波细胞破碎仪的破碎时间为1.5～2.5h。

5.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(4)中：悬浮缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.16～0.24mL，DNase I的用量为每克黄化苗鲜重加0.4U～0.6U；终止酶解反应是向酶解液中加入预冷的PH为8.0的EDTA至终浓度为50mmol/L；洗涤缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.5mL～1mL。

6.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：在进行步骤(5)之前，步骤(4)重复进行至少1次。

7.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)中：悬浮缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.2～0.3mL；裂解缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.9～1mL；在加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)后，用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂解缓冲液中混匀。