[发明专利]猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物材料技术领域的制备方法，具体是一种能够裂解或增强裂解酶裂解猪链球菌的穿孔素(Holin)的制备方法。

背景技术

猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。对于猪链球菌病的治疗主要是抗生素治疗，然而，随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株的产生进一步加剧。穿孔素是由噬菌体基因组编码的一种疏水性的跨膜蛋白，在特定阶段插入胞质膜形成非特异性的孔洞或损伤，促使裂解酶能接近其作用靶位，有效调节裂解酶裂解细菌。噬菌体穿孔素与裂解酶配合使用，能大大提高裂解酶特异性攻击细菌的效率。所以，穿孔素作为新型抗菌药物具有一定的优势。本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得了纯化的有活性的穿孔素，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。

经文献检索发现，王丽平、陆承平、唐家琪在《微生物学报》2004年第44卷第6期第794～799页发表了“32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性”，文中提及，一些猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株以耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类、氨基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药，寻找另一种抗菌机制或抗菌药物显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种裂解猪链球菌的穿孔素的制备方法。本发明获得的纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶的裂解效率。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA；

步骤二，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增穿孔素基因；

步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；

步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。

步骤三中，所述的原核表达采用的质粒是pET-28a(+)，表达的穿孔素分子约16kDa。

步骤三中，所述的融合蛋白是指一个分子量为16kDa的融合蛋白。

步骤四中，所述的纯化融合蛋白是指经过Ni柱纯化，得到有活性的穿孔素。

所述的步骤四中的穿孔素发挥最佳裂解作用的条件是：采用pH5.2醋酸钠缓冲液、最佳反应温度是37℃。

本发明利用PCR扩增猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得目的片断，再将目的片断与pET-28a(+)载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌BL21表达，经纯化得到有活性的穿孔素，获得的穿孔素在体外可裂解或增强裂解酶对多株临床分离的猪链球菌的裂解作用，并且对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有独立裂解作用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶的裂解效率。比较噬菌体穿孔素与裂解酶对细菌的裂解效率发现，裂解酶对高压处理过的猪链球菌具有裂解作用，当加入穿孔素后，其与裂解酶可协同、高效裂解未经处理的猪链球菌，裂解效率显著提高。

具体实施方式

以下实例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

一、噬菌体的提纯、DNA的制备和穿孔素的表达