[发明专利]与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体地涉及与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记及其应用。

背景技术

氮素是水稻生长中最重要的营养。半个世纪以来，随着矮秆耐肥高效品种的培育与推广，世界各国都把增施氮肥作为增加水稻产量的重要农业措施。然而，尽管近年来化肥用量年年增长、在生产成本中的比重逐年增加，粮食产量却一直徘徊不前。从1984年到1993年，我国化肥用量增加了81％，而粮食总产只增加了14.6％。而且，高氮引起的环境污染问题日趋严重。据统计，我国氮肥的平均利用率只有35％，养分损失不仅严重浪费了有限的养分资源，由于其向水体和大气的排放，也带来了令人担忧的环境问题。有的地下饮用水中NO₃^-含量超过上限50mg/L，NO₃^-污染会引起许多疾病，如高铁血蛋白缺氧症、胃癌和幼儿畸形等。

水稻是全球半数人口的主食，我国是水稻生产大国，全国水稻年播种面积达4.8亿亩，约占粮食作物总面积的26.6％左右。由于水稻与其他作物不同，需水量大，施肥次数多，搁田或雨量大引起的NO₃^-流失多，水稻生产成为目前最大的污染源之一。这一现象在欧洲早已引起极大关注，德国巴登符腾堡州1989年就把旱作施肥列为地下水硝酸盐污染的重要来源，通过专门法律条款限制水资源保护区的旱作种植及氮肥施用量。因此，探讨有限氮素供应条件下作物高产高效的新途径不仅是实现我国两高一优农业生产目标所必需的，而且也是保护环境、造福子孙后代的重要问题。

水稻育种实践证明，利用氮素营养调控基因培育新品种将是提高氮素利用效率和作物产量以及减少环境污染最为经济有效的方法。随着分子生物学的发展，使难以鉴定、易受环境影响的农艺性状采用分子辅助育种已成为可能，该技术可在早代进行准确、稳定的选择，从而加速育种进程，提高育种效率，但该技术的基础是必须拥有优良的目标基因及与之紧密连锁的分子标记。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述缺陷，用分子生物学方法以氮高效水稻品种为材料，筛选和寻找新的、而且稳定存在的与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记，用于水稻辅助选择育种及新品种鉴定，同时，根据所得分子标记也有助于水稻氮营养调控基因的克隆。

本发明所述的氮营养调控基因即氮高效基因。

实现上述目的的技术方案如下：

与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记，所述的分子标记为位于水稻第2染色体上的SSR分子标记RM5897，其核苷酸序列如下：

上游引物5’-GGCATCTTCCCCTCTCTCTC-3’

下游引物5’-CCAACCCAAACCAGTCTACC-3’。

与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记，所述的分子标记为位于水稻第2染色体上的STS分子标记AP5756，其核苷酸序列如下：

上游引物5’-CTATTGGTGGTTAGGGCTGAT-3’

下游引物5’-AGTTGATTTAGATGTGTTTTA-3’。

上述与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记RM5897和AP5756，是使用下述方法得到的：

(1)氮高效基因供体亲本来自中国水稻研究所的籼稻品种窄叶青8号(ZYQ8)，与普通粳稻品种京系17(JX17)进行杂交，利用F 1代花药培养获得加倍单倍体(DH)群体，从中获得氮高效株系DH78，通过DH78与JX17回交和自交，进行配组和基因定位，统计分离群体单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用Mapmaker EXP3.0b计算标记与氮营养调控基因之间的遗传距离。

(2)用CTAB法提取水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA。

(3)采用SSR和STS分子标记方法进行水稻氮营养调控基因分子标记的筛选。

(4)筛选出一个SSR分子标记RM5897和一个STS分子标记AP5756，经连锁分析，发现这两个标记与水稻氮营养调控基因相连锁，分别位于水稻氮营养调控基因的两侧。

采用SSR和STS分子标记进行筛选与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记的方法是：

(1)SSR、STS引物在亲本以及他们的杂交后代间DNA多态性分析：