[发明专利]一种包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种包含HLZ(溶菌酶)乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞。

背景技术

乳腺炎(mastitis)主要是由葡萄球菌(staphaylococcus)，链球菌(streptococcus)和杆菌(coli)所引起的可传播的细菌性炎症。由于病原菌广泛的存在于畜舍中且潜伏期长，不易根除，使得细菌性乳腺炎给畜牧业的生产带来了巨大的经济损失。目前，针对奶牛乳腺炎的主要预防和治疗措施是使用头孢类或内酰胺类抗生素，但抗生素的长期使用会引起病原菌的耐药性，以及牛奶中药物残留的问题，故需要寻求一种新的治疗乳腺炎的方法。

自身能够特异性的在乳房携带或者分泌抗乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。转基因动物的生产可以追溯到20世纪70年代中叶，用原核显微注射生产转基因动物持续了20多年(BOWEN RA，REED ML，SCHNIEKE A，et al.Transgenic cattle resulting from biopsied embryos：expression of c-ski in atransgenic calf[J].Biol Reprod，1994，50：664-8.)，但外源基因的随机整合和配子系传送外源基因的不确定性限制了这种技术的广泛应用。在小鼠上，胚胎干细胞可以代替原核注射(BRANDON EP，IDZERDA RL，MCKNIGHT GS.Targeting the mouse genome：a compendium of knockouts(Part II)[J].Curr Biol，1995，5：758-65.)，但胚胎干细胞系还没有在家畜上建立(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A，CHEN LR，et al.Isolation of pluripotent stem cells fromcultured porcine primordial germ cells[J].Biol Reprod，1997，57：1089)。

而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J，BHUIYAN M.M.U.，HYUN Y J，et al.An approach for producing transgeniccloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha1-antitrypsin gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，其突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(WHEELER MB，WALTERS EM.Transgenic technology and applications inswine[J].Theriogenology，2001，56：1345-69.)。

溶菌酶(lysozyme)是一种天然的抗菌肽，能有效的水解革兰氏阳性菌细胞壁，抑制细菌生长，广泛的存在于唾液，眼泪和乳液中。溶菌酶在人体中的含量非常高，达到了400μg/ml，能够有效的抑制细菌生长，但在在反刍动物中，溶菌酶的含量非常低，且对细菌无显著作用。如果能够利用基因工程技术将溶菌酶整合到反刍动物的基因当中，使得外源性的溶菌酶被表达之后，将能够很好的解决反刍动物的乳腺炎的问题。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种HLZ乳腺特异性表达载体，以及基于该载体的包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞，为克服奶牛乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种HLZ乳腺特异性表达载体，包含目的基因HLZ，分别在HLZ基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.2所示的CSN5序列，3′端插入如SEQ.ID.NO.3所示的CSN3序列，作为调控元件。

所述HLZ乳腺特异性表达载体在HLZ基因与CSN3序列之间还包含抗生素正筛选基因和标记基因，在CSN5序列的上游和CSN3序列的下游还包含相同的抗生素负筛选基因。

所述的抗生素正筛选基因为neo基因，所述的标记基因为IRES-EGFP基因，所述的抗生素负筛选基因为TK基因。