[发明专利]一种非整合的、长时间的、可删除表达载体的表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，具体涉及一种表达载体以及基于该表达载体的表达系统。

背景技术

在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法多种多样。例如，1)可以利用转染普通质粒(Plasmid DNA)进行非整合的瞬时表达，还可通过将质粒整合到基因组而实现基因的长时间表达；2)利用可包装为病毒颗粒的病毒载体，如慢病毒载体(lentiviral vector)、反转录病毒载体等，需要将外源基因导入细胞并整合到细胞的基因组中得以稳定长期地表达外源基因；3)腺病毒(adenovirus)载体可以将外源基因导入细胞，并以非整合的形式在细胞内表达，但这种方法只能实现外源基因的短期表达，不能实现长时间(一个月左右)的表达。

这些方法中有的可以实现外源基因的长时间表达，但需要外源基因整合到细胞的基因组中，从而破坏了细胞的基因组的完整性；有的虽然可以保证细胞基因组的完整，但表达的时间比较短。更重要的是这些方法都不能人为地控制删除外源基因表达载体，因而在生物医学工程中存在着很大的风险。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种非整合的、长时间的、可调控删除表达载体的表达系统。

为实现上述目的，本发明首先提供一种表达载体，该表达载体的复制子采用人疱疹病毒复制子(replication origin，Orip)，并引入EBNA-1表达盒，在所述复制子的两端、EBNA-1的两端或者Orip-EBNA-1的两端具有重组酶识别序列。

EBNA-1基因编码的核抗原将表达载体质粒以游离染色体的形式存在，在细胞中实现外源基因的非整合且长期表达。

由于EBNA-1基因的启动子为其病毒原始启动子，而该启动子在许多种类的细胞中几乎不会被激活，因而只能在少数血液系统细胞、肝脏细胞及心肌细胞等少数细胞中使用。为此，本发明将该表达盒的启动子替换为具有真核细胞广谱性的强启动子，诸如CMV、PGK、CAG或EF-1α等等启动子，使得其能够在各种不同的细胞中表达，特别是在哺乳动物细胞中表达。

本发明在复制子或EBNA-1的两端加入重组酶识别序列，其能够在重组酶的作用下将识别序列内的DNA序列删除，从而使质粒不能复制，在细胞传代时质粒将被逐渐删除。所述的重组酶识别序列可以采用Cre/LoxP系统的Loxp序列或者是为FLP/FRT系统的frt序列。当然，也可以是Loxp-frt的融合序列。

进一步，本发明表达载体还包括筛选标记，例如药物筛选标记或者实时筛选标记，或者它们的组合。药物筛选标记基因可以是新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(Hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)或嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)等等基因。实时筛选标记基因可以是荧光蛋白基因或非荧光标记基因，荧光蛋白基因可以是诸如绿荧光蛋白基因、黄荧光蛋白基因以及红荧光蛋白基因等等，非荧光标记可以是免疫组化标记等等。本发明的一个实施例中采用了neo与GFP筛选标记的组合，其引入的筛选标记表达盒是由CMV启动子、增强型绿荧光蛋白基因(EGFP)、核糖体进入位点(internal ribosome entrysite，IRES)以及新霉素磷酸转移酶基因(neo)构成的CMV-EGFP-IRES-NEO选择标记基因。利用实时荧光标记可将含有载体质粒和已丢失载体质粒的细胞区分开来。

在本发明的实施例中，采用pBR322作为出发质粒，构建了A).pBR322-rrs-Orip-rrs-EBNA1-MCS；B).pBR322-Orip-rrs-EBNA1-rrs-MCS；C.pBR322-rrs-Orip-EBNA1-rrs-MCS；以及D).pBR322-rrs-Orip-EBNA1-rrs-EGFP等表达载体。

本领域技术人员可利用上述表达载体构建各种含有外源基因的重组载体，用于基因的功能研究或各种应用。因此本发明还包括由上述表达载体构建的重组载体，以及含有所述表达载体或重组载体的宿主细胞，例如哺乳动物细胞。