[发明专利]一种海藻糖的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海藻糖的生产方法，特别是一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，属于发酵工程及微生物技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，化学名α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glycopyranosyl-α-D-glycopyranoside)，是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖。广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类和昆虫中。海藻糖具有独特的生物学功能，可以保护蛋白质，生物膜及敏感细胞的细胞壁免受干旱、冷冻和渗透压的变化而造成的伤害，可作为不稳定药品、食品和化妆品的稳定剂、多种食品和药品甜味剂、种子的包衣、冷冻干燥菌株的保护剂等；海藻糖还可保护DNA防止放射线引起的损伤。

海藻糖的生产方法包括微生物抽提法、化学合成法、微生物发酵法、基因重组法、酶转化法等。酶转化法制取海藻糖的途径有多种，按其作用的底物，主要分为以葡萄糖、麦芽糖、淀粉为底物的三种方法。

1、以葡萄糖为底物

人们在研究酵母的生物合成途径时，发现酵母利用体内的6-P-海藻糖合成酶和6-P-海藻糖磷酸酯酶，经两步作用将两个葡萄糖分子转化为海藻糖。据此，Hidcki Kizawa等人在小球菌变异株菌体内提取出合成酶，转化葡萄糖为海藻糖。但这一过程需要消耗高能物质UDP或GDP，且酶活很不稳定，因此用该方法很难实现大规模的工业化生产。

2、以麦芽糖为底物

以麦芽糖为底物的酶转化法目前发现有两种。

(1)利用某些磷酸化酶由麦芽糖二步转化为海藻糖

Sawao Murao等详细研究了由麦芽糖生物合成海藻糖的途径：

第一步反应：麦芽糖在海藻糖磷酸化酶的作用下生成葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸。第二步反应是葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸在海藻糖磷酸化酶作用下生成海藻糖和磷酸。日本专利曾介绍用麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶处理麦芽糖就可以生产海藻糖。酶反应完成后，从反应液中除去沉淀物，含有海藻糖的液体进一步用阴离子交换树脂纯化，然后，再用一种硼酸型阴离子交换树脂吸附海藻糖，采用硼酸钾分级洗脱和收集。含有海藻糖部分经阳离子交换树脂处理和浓缩，然后加入少量乙醇蒸馏除去硼酸，最后的浓缩液用乙醇进行重结晶，可得到二水海藻糖晶体。研究表明，此法反应生产海藻糖转化率较低且酶制备及产物提取困难，不适宜于工业化生产。

(2)利用海藻糖合酶将麦芽糖-步转化为海藻糖

许多细菌中都有海藻糖合酶，如脂肪杆菌(Pimelobacter sp.)、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)、水生嗜热菌(Thermus aquaticus)等。这种酶是分子内转糖基酶，能将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化成α-1，1糖苷键，但不作用于葡萄糖，麦芽三、四、五糖，麦芽寡糖、曲二糖、黑曲霉二糖、异麦芽糖、海藻寡糖、蔗糖、松二糖、异麦芽寡糖和乳糖。这种酶在催化麦芽糖转化为海藻糖的过程中不消耗高能物质，不需要磷酸，且转化率高达70-80％，海藻糖产率和麦芽糖的浓度(2.5％-40％)无关。这为海藻糖的大规模生产提共了有利条件。

该酶催化麦芽糖生成海藻糖的反应是：

(3)以淀粉或淀粉水解物为底物

低聚麦芽糖苷基海藻糖生成酶(MTSase)和低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)是首先在节杆菌Q36中发现的，这两种酶能作用于麦芽寡糖或淀粉生成海藻糖。其中以直链淀粉为底物生产海藻糖的机理如下：

该反应分两步完成，第一步，MTSase由麦芽低聚糖(淀粉液化液)的还原性末端开始，通过分子内转苷作用，将α-1，4键转变成α-1，1键，使原麦芽低聚糖转变为带有一个海藻糖结构的麦芽低聚糖，是一种分子内转糖基酶，称为麦芽寡糖基海藻糖合酶；第二步，MTHase专一地作用于α-1，1键相邻的α-1，4键，从而使原麦芽低聚糖变为少两个葡萄糖苷的低聚糖和游离的海藻糖，称为麦芽寡糖海藻糖基水解酶。如果n-2≥3，则上述反应继续进行，所以如果反应完全，其最终产物主要为海藻糖及一部分葡萄糖和麦芽糖。

目前商品化的海藻糖主要从酵母细胞中提取，收率低且成本高，限制了海藻糖的广泛应用。

发明内容