[发明专利]一种从基因文库钓取未知基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用部分重叠PCR的方法从基因文库钓取未知基因的方 法。

背景技术

传统方法利用核酸杂交从文库中钓取基因，这种方法的缺点是需要用同位 素标记的探针、需要筛选基因库，不仅有放射性而且工作量极大、假阳性率高 的缺点。近年来，虽然已有从文库中钓取未知基因的相关方法，例如Conner等 (Isolation of Drosophila Activin and Follistatin cDNAs using novel MACH amplification protocols，2002，Gene)利用一对完全重叠引物，对来自文库DNA 进行扩增，经Dpn I消化后，转化细胞，这种方法的缺点是PCR为线性扩增， 扩增产物不可见，转化效率低，操作性差；Celniker等(Rapid and efficient cDNA library screening by self-ligation of inverse PCR products，2005，Nucleic Acids Research)利用一对没有任何重叠、磷酸化的反向引物，进行扩增，然后连接 环化，从cDNA文库中钓取基因，这种方法的缺点是效率低，而且费时。

发明内容

本发明要解决的技术问题是利用部分重叠引物扩增，使扩增产物可见，操 作性强，转化效率高，同时利用DpnI酶切，和细胞降解甲基化模板。用此方 法从基因文库中钓取基因具有效率高，简单、省时的优点。用这种方法做成试 剂盒，将大大方便使用者，实现从基因文库中快速钓取未知基因。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种利用部分重叠PCR的方法从基因文库钓取基因的方法。 其步骤包括：

(1)模板甲基化：用甲基化酶对文库DNA甲基化，

(2)引物设计：根据未知基因的部分序列设计一对部分重叠的引物，引 物长度为25-30个碱基，引物包括5′端重叠部分和3′端非重叠部分，引物长 度为25-30个碱基，引物重叠部分碱基为15-18个，非重叠部分碱基至少10个，

(3)PCR扩增：以甲基化文库DNA为模板，加入上述部分重叠引物，进 行PCR扩增，

(4)DpnI消化：在步骤(3)获得的扩增产物中，加入DpnI限制性内切 酶，消化甲基化模板，

(5)转化DMT细胞：用DpnI消化产物转化DMT细胞，

(6)筛选得到包含目的基因的质粒DNA。

所述根据未知基因的已知部分序列是指来自同一物种或相关物种的已知 基因。

所述甲基化酶为dam甲基转移酶。

所述步骤(4)中，加入DpnI限制性内切酶，消化甲基化模板的条件为37℃ 60min。

所述步骤(5)中，消化产物转化DMT细胞后，可进一步消化清除甲基 化模板。

与传统方法相比，本发明提供的一种利用部分重叠PCR方法从基因文库 钓取基因的方法，具有快速、高效的特点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明

图1：使用本发明方法钓取未知基因的示意图，

其中：A：文库DNA；

B：甲基化的文库DNA；

C：筛选得到的包含目的基因的质粒DNA。

具体实施方式

实施例中所用的材料及来源分别为：人脑细胞cDNA文库(Invitrogen公 司)，人肝细胞cDNA文库(Invitrogen公司)，dam甲基转移酶、DpnI限制性 内切酶(NEB公司)，引物合成(北京英俊生物技术有限公司)。TransStart FastPfu DNA Polymerase、DMT化学感受态细胞、EasyPure PCR Purification Kit (北京全式金生物技术有限公司)。

实施例1：从人脑细胞cDNA文库中扩增hRrp46p基因

1.模板的甲基化

首先用CpG甲基转移酶对人脑细胞eDNA文库进行甲基化：

cDNA文库(1μg/μl)            1μl

dam甲基转移酶(8u/μl)         0.4μl

10×NEBuffer 2                1μl