[发明专利]一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法。 

背景技术

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(简称NGAL)是1993年在中性粒细胞内首先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾发过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。 

在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。 

急性肾功能损伤预后将发展成为急性肾功能衰竭。通用的诊断方法如测定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)，只能在损伤后一天甚者几天内检测。有研究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布0.7-9.6ng/ml，平均值为5.3ng/ml。而血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，随机检测重病患者，尿液NGAL的浓度为110ng/ml到40000ng/ml不等。而他们EDTA抗凝血浆检测结果为25ng/ml到3491ng/ml。根据急性肾衰竭患者检测的90％阳性预测值判断，尿液中NGAL的阳性判断值为350ng/ml，而血浆检测的阳性判断值为400ng/ml。 

同源性分析表明，NGAL与小鼠的24p3和大鼠的neu相关lipocalin(neu-related lipocalin，NRL)具有很高的同源性。小鼠的24p3在肝脏中合成，炎 症反应时上调，另外24p3也见于巨噬细胞和子宫内膜，尤其是生殖期的子宫内膜。用类固醇激素可使相应组织中的24p3水平升高，而一些生长因子和肿瘤促进因子也可以使其升高。猴毒SV40、多瘤毒或其他毒感染可以刺激培养的小鼠肾细胞24p3mRNA的表达增加7-10倍。且随着大T抗原的合成的增加而升高。因此24p3被认为是癌基因产物。这同时表明NGAL可能是人类的一种新的癌基因。 

实验证明，在卵巢癌细胞系、结肠肿瘤和乳腺癌等中的NGAL的表达明显增强。免疫组化证明在肺癌组织中的NGAL强阳性，而支气管肺泡细胞癌和粘液细胞癌染色最强，NGAL在胰腺癌中会从阴性增加到强阳性。 

综上所述，建立针对样本中NGAL的快速检测方法为该蛋白的研究将会提供一个强有力的工具。 

发明内容

本发明提供了检测样本中NGAL的方法所述方法包含以下步骤： 

i)使用相关器械收集样本包括人的血清、血浆和尿液， 

ii)样本与抗体接触反应， 

iii)检测样本中NGAL的浓度。 

优选通过免疫化学方法来测定NGAL水平，这种方法的例子包括但绝不限于免疫比浊法、夹心法ELISA、竞争法ELISA。 

对生物样本，可以用任何提供满意的分析特异性、灵敏度和精确度的方法来进行。检测实验中，使用NGAL的单克隆、多克隆抗体或任何可与NGAL特异性结合的分子。结合分子首先固相化捕捉样品中的NGAL形成复合物，而另外一个标记可检测的结合分子再结合上述复合物，最后通过特定方法显示出复 合物量的值从而间接反应出样品中NGAL的含量。另外可以直接利用游离的NGAL抗体或偶联乳胶颗粒以胶体形式存在的抗体与样品中的NGAL直接结合所形成的复合物引起浊度变化；用光投射强度或光散射强度表征这种变化；从人NGAL标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的人NGAL的含量； 

附图说明

图1是夹心法ELISA检测重组人NGAL标准曲线图； 

图2是竞争法ELISA检测重组人NGAL标准曲线图。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1 乳胶增强免疫比浊法检测人尿液中的NGAL含量 

实现本实例的技术方案：一种检测人NGAL的免疫比浊法，用抗NGAL的多克隆抗体首先与乳胶交联，然后用交联后的乳胶溶液与待检标本的NGAL反应，所形成的复合物引起浊度变化；用光投射强度或光散射强度表征这种变化；从NGAL标准品的浓度与相应光散射强度或光投射强度的标准曲线查出待检样本的NGAL含量；其中所用的NGAL的多克隆抗体效价至少为1∶500，不含杂抗体，具有识别NGAL多种抗原决定簇；待检标本用稀释剂做1∶200-1∶1000稀释；