[发明专利]Mitofilin基因敲除小鼠模型的制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制备方法及用途，具体地，本发明提供了一种Mitofilin杂合子小鼠的制备方法以及Mitofilin作为潜在的心脏保护因子在制备药物中的用途。

背景技术

1.线粒体损伤与心肌细胞凋亡

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在自身基因调控下进行的一种主动死亡，具有独特的形态结构和生物化学特征，主要表现为：细胞核染色质固缩，凋亡小体出现，梯形脱氧核糖核酸(DNA)电泳图谱形成。研究证实，心肌细胞凋亡与原发性高血压、心肌缺血再灌注损伤、血管成形术后再狭窄、心律失常、心肌病和心肌炎、心力衰竭、动脉粥样硬化、动脉瘤等多种心血管疾病有关。

线粒体是细胞内一种重要的细胞器，它具有复杂的亚微结构和功能转换系统，通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供能量。生物体内90％以上的ATP是由线粒体产生，因此线粒体被称为细胞器的“动力工厂”。线粒体被两层膜包绕，外膜通透性较高；内膜有更严格的选择性，它对离子、小分子物质的通透性，在线粒体的结构与功能的维持中非常重要，它有利于维持内膜两侧的电势差，并在一定条件下形成跨膜质子梯度，后者是氧化磷酸化的必要中间过程。

线粒体占心肌细胞体积的45％，许多研究发现，当心肌细胞发生凋亡时，出现线粒体结构与功能的改变。如Sharow等在动物试验中发现，心肌细胞凋亡主要发生在梗死心肌周围，而离梗死心肌越近，线粒体损伤程度越重、数量越多。过氧化氢(H₂O₂)能够诱导心肌细胞凋亡，Chen等在观察H₂O₂对培养心肌细胞凋亡的研究中发现，在培养的心肌细胞中加入H₂O₂后，首先出现线粒体呼吸功能减弱，继而出现一系列细胞凋亡的特征：DN的降解，寡聚DNA梯形图谱的形成。Cook等对其机制进行了研究，发现加入H₂O₂后15～30min内，细胞色素C即从线粒体释放于胞浆中，15～30min后线粒体跨膜电位降低，这个过程约持续1h，此后线粒体跨膜电位发生不可逆性丧失，继而出现心肌细胞凋亡与坏死。这均显示，线粒体在心肌细胞凋亡中发挥着重要作用。

Okamura等对线粒体与心肌细胞凋亡及心肌坏死关系方面进行了研究。他结扎大鼠的前降支30min后再灌注模型，然后分成三组，分别加入YVAD(Caspase 1抑制剂)、DEVD(Caspase 3抑制剂)及对照组，研究发现，YVAD及DEVD均显著减少心肌细胞凋亡，然而三组坏死心肌面积无差别。进一步研究显示，Caspase抑制剂、线粒体保护剂、自由基清除剂及一些药物均可减少心肌细胞凋亡，然而它们在缩小心肌坏死面积方面存有较大差异。Yaoita等认为，心肌细胞缺血时，一些促凋亡及促坏死信号均作用于线粒体这一共同通路而发挥作用。作用于线粒体后途径，仅能抑制心肌细胞凋亡，不能抑制心肌细胞坏死途径。

这些研究表明，只有作用于线粒体前及线粒体水平的措施才能有效抑制心肌细胞凋亡，缩小坏死心肌面积。明确这一机制对指导临床用药也有重要意义，如血管紧张素转换酶抑制剂(ACE I)能有效减少心肌梗死后坏死心肌面积，改善心衰症状。现在的研究表明，ACE I类药物能够促使心肌细胞线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)数量增多、功能改善，细胞凋亡减少，说明ACE I类药物可能通过线粒体水平而发挥抑制心肌细胞凋亡及坏死等积极作用。

总之，线粒体在心肌细胞凋亡中起中心作用，决定心肌细胞走向凋亡还是坏死。线粒体在凋亡凋节中也十分重要，绝大多数蛋白质通过线粒体起到调节作用。明确线粒体在细胞凋亡中起关键作用，对于我们进一步探讨心脏疾病的发生及防治均有重要意义。

2线粒体内膜蛋白一Mitofilin