[发明专利]一种制备担子菌原生质体的试剂盒及其使用方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学研究领域，具体涉及一种制备担子菌原生质体的试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

原生质体的制备是细胞生物学研究领域的最广泛和最基本的技术。现有技术中常用市售的蜗牛酶和纤维素酶等混合使用来制备原生质体，但制得原生质体的量比较少，活力不高，且耗时。目前，国内外尚无适合制备担子菌原生质体的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备担子菌原生质体的试剂盒，该试剂盒用高活力的酶，在最佳的酶解条件下，能快速制备出大量高质量的担子菌原生质体。

本发明的目的还在于提供上述试剂盒的应用和使用方法，其应用领域广，使用方法操作快速、简易，得率高。

本发明提供的制备担子菌原生质体的试剂盒，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液R1或等渗缓冲液R2，所述的等渗缓冲液R1包括硫酸镁和磷酸缓冲液，所述的等渗缓冲液R2包括氯化钾和磷酸缓冲液。

本发明所述的硫酸镁和氯化钾的摩尔浓度为5.5～6.0mol/L。

优选的，硫酸镁和氯化钾的摩尔浓度为6.0mol/L。

本发明所述的磷酸缓冲液的PH为5.6～5.8，所述的磷酸缓冲液通过磷酸二氢钠和磷酸氢二钠水溶液配制获得。

优选的，磷酸缓冲液的PH为5.8。

等渗缓冲液R1或等渗缓冲液R2的制备方法为：按量取七水硫酸镁、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(分析纯)，加双蒸水搅拌溶解后定容，采用湿热灭菌法，103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15～20min灭菌后装于塑料瓶，4℃保存。

本发明提供的上述试剂盒在制备侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞、云芝、蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳的原生质体中的应用。

本发明提供的上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)按常规方法培养菌丝；

(2)取常规培养的菌丝，过滤，用无菌水冲洗，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液R1洗涤，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2洗涤，将洗涤后菌丝置于离心管中，室温下离心后，收集菌丝；

(3)对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，将担子菌裂解酶用溶液R1配制成溶液后过滤除菌，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，将担子菌裂解酶用溶液R2配制成溶液后过滤除菌，收集滤液到无菌离心管中，并加入收集的菌丝；

(4)将离心管置于水浴中，间歇振摇进行水解反应；

(5)反应结束后，将反应液加入离心管中，离心后收集原生质体，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液R1定容，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2定容；

(6)采用血球计数法计算原生质体的量，并冷藏保存备用。

在上述步骤中：

步骤(3)中配制含担子菌裂解酶的R1或R2溶液的质量浓度为10～15mg/mL。

步骤(3)中过滤除菌用的微孔滤膜的直径为0.22μm。

步骤(3)中菌丝和含担子菌裂解酶的R1或R2溶液的料液比为90～110mg/ml。

步骤(4)中水浴的温度为28～30℃，反应时间为1.5～2h。

步骤(2)和步骤(5)中离心管的转速为1000rpm，离心时间为10min。

本发明具有下述优点：

(1)操作快速、简易高效高质价廉，整个过程只需要约2h；

(2)得量高，反应2h所得到原生质体量约为10⁵～10⁶个/毫升酶液；

(3)活性高，制备的原生质体保存在4℃冰箱，可存活3～5天；

(4)细胞生长状态好，可满足对目的基因进行细胞融合、细胞学定位、免疫共沉淀、Western杂交等多种研究目的。

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，如担子菌裂解酶也可用其它类同的溶壁酶来取代，缓冲液的其他常规制备方法等，均可实现本发明的目的。

实施例1