[发明专利]一株用于生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一株胞外表达L-天冬酰胺酶II的工程菌，及其构建方法和应用。本发明是利用现代生物技术、基因工程方法来构建胞外表达L-天冬酰胺酶II的工程菌，并选择合适的培养基和培养方法，使得到的酶活力达到较高水平。

背景技术

L-天冬酰胺酶(E.C.3.5.1.1)可催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，人们已从不同细菌源获得了L-天冬酰胺酶。

1953年，Kidd发现豚鼠血清有抗肿瘤作用。后来，Broome证实了豚鼠血清的抗肿瘤因子是血清中的L-天冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感肿瘤细胞氨基酸、蛋白质和核酸的代谢紊乱，从而抑制肿瘤生长。

大肠杆菌含有天冬酰胺酶的两种同工酶：L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II。L-天冬酰胺酶I位于胞质溶胶中，对天冬酰胺的亲和性低。L-天冬酰胺酶II(Accession：NP 417432)位于周质，对天冬酰胺具有高亲和性。因此，L-天冬酰胺酶II可通过去除细胞外的天冬酰胺，来治疗依赖L-天冬酰胺进行蛋白质合成的肿瘤或癌症，其在治疗白血病，例如急性淋巴细胞白血病中特别有效。

基因重组技术的出现，使人们可以根据自己的意愿表达蛋白质。通过国内外专利及文献检索发现，已有用基因工程菌来表达并生产L-天冬酰胺酶，但酶都定位于细胞内周质空间中，胞外表达的报道极少，还没有用于工业生产。本发明的目的是将原本存于在细胞内周质中的L-天冬酰胺酶II转移到细胞外，以便于产物回收。

本发明提供了一种不同于CN1705880A中所公开的工程菌的构建方法以及培养条件。

发明内容

本发明提供了表达L-天冬酰胺酶II工程菌，及其构建和发酵培养方法。

本发明所说的表达L-天冬酰胺酶II工程菌，由重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21而得到；其中重组质粒pET-ASP的结构如图1所示。

上述重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将L-天冬酰胺酶II基因连接在表达质粒pET22b上，得重组质粒pET-ASP；

2)用重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。

所说的L-天冬酰胺酶II基因，可通过基因工程技术从大肠杆菌中获得。作为本发明的一个实例，所说的L-天冬酰胺酶II基因是从E.coli JM109中分离提取染色体DNA，再用PCR方法从上述染色体DNA中钓取得到。

应用本发明重组工程菌生产L-天冬酰胺酶II的方法，是将重组工程菌进行培养发酵，表达产生L-天冬酰胺酶II。将发酵液离心或过滤除去菌体，清液过亲和层析柱，洗脱液脱盐后冷冻干燥，即可得到产品。

上述生产方法中，具体地，用于重组工程菌培养的培养基为：

1)种子培养基配方为：牛肉膏含量5g/L～25g/L，蛋白胨含量5g/L～20g/L，NaCl含量8g/L～15g/L，氨苄青霉素含量为0.02g/L～1.85g/L，pH值为6.5～7.8；优选的配方为：牛肉膏含量5g/L～10g/L，蛋白胨含量9g/L～15g/L，NaCl含量9g/L～13g/L，氨苄青霉素含量为0.08g/L～1.25g/L，pH值为6.9～7.3；

2)摇瓶培养基配方为：酵母浸出膏含量15g/L～40g/L，蛋白胨含量8g/L～30g/L，甘油含量2g/L～10g/L，pH值为6.5～7.8；优选的配方为：酵母浸出膏含量20g/L～25g/L，蛋白胨含量11g/L～15g/L，甘油含量3g/L～6g/L，pH值为6.9～7.3；

3)发酵培养基配方为：玉米浆含量50g/L～150g/L，甘油含量为5g/L～30g/L，pH为6.5～7.5；优选的配方为：玉米浆含量为70g/L～100g/L，甘油含量为9g/L～14g/L，pH为6.9～7.3。

上述生产方法中，具体地，培养条件如下：

摇瓶培养条件：接种量0.5％～5％，温度30℃～40℃，振荡转速180rpm～300rpm，装液量8％～25％，培养0h～10h后加入诱导剂IPTG，终浓度为1g/L～10g/L，诱导8h～24h。优选的摇瓶培养条件为：接种量1％～2％，温度35℃～38℃，振荡转速200rpm～230rpm，装液量10％～15％，培养1h～4h后加入诱导剂IPTG，终浓度为2g/L～4g/L，诱导1h～4h；