[发明专利]一种酶制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种酶制剂的制备方法，具体是一种硫化氢产生酶制剂的制备方法，制备的酶制剂对治疗因内源性硫化氢产生不足而引起的疾病具有潜在的应用价值。

技术背景

长期以来，硫化氢一直被认为是一种有毒的气体。然而最近研究表明，硫化氢作为气态信号分子在多种生理过程中发挥重要作用，具有广泛的生物学效应，显示出极大的治疗性应用前景。

正常情况下，机体的稳态可通过神经和体液系统进行内源调节。一氧化氮和一氧化碳是两类早已确认的内源气态调节因子，最近，硫化氢被证实为第三种气态信号分子，共同参与稳态的调节。研究表明，正常机体组织中存在着一定浓度的硫化氢(如大鼠血清中约含46μM硫化氢，哺乳动物脑组织中约含50-160μM硫化氢，哺乳动物胃肠道中的硫化氢浓度更高，达0.2～3.4mM)，它们1/3以气态形式存在，2/3以离子(主要是HS^-)形式存在。这些内源性硫化氢主要由两类磷酸吡哆醛依赖性酶：胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS，EC 4.2.1.22)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CGL；又称为γ-胱硫醚酶，γ-cystathionase，CSE，EC 4.4.1.1)催化产生。硫化氢可直接作用于K_ATP通道，通过减少细胞外Ca²⁺的内流及促进内皮细胞释放内皮超极化因子等方式来舒张血管平滑肌，同时，还可通过对丝裂原激活蛋白激酶的作用抑制血管平滑肌细胞增殖，促进其凋亡，改善血管重构。

硫化氢的主要生理功能有：

维持血压稳定：研究表明，自发性或诱发性高血压大鼠的血浆中硫化氢浓度显著低于正常大鼠，如果静脉注射或腹腔注射NaHS(一种硫化氢的供体)，不仅可提高血浆中的硫化氢水平，还能显著降低大鼠的血压(Shi et al.，AmericanJ Physiology-Heart and Circulation Physiology.2007，293：2093-2100)。对正常大鼠体外灌注胱硫醚β-合成酶或胱硫醚γ-裂解酶的激活剂，可使受试动物的血压降低，反之，如果灌注这些酶的抑制剂，则会使受试动物的血压升高(Webb et al.，J Pharm Experiment Threapeut.2008，324：876-882)。Yang等用敲除CSE基因的突变小鼠进行实验，发现这种突变小鼠其硫化氢的水平显著下降，并表现出明显的高血压倾向和依赖内皮的血管舒张功能丧失，如果静脉注射或腹腔注射NaHS，可使血压回归正常(Science，2008，322：587-590)，这些研究都说明硫化氢在血管扩张和血压调节过程中发挥着重要作用。

保护心脏：心肌缺血损伤的大鼠其血浆硫化氢水平显著降低，心肌CSE活性下调，外源性给予NaHS可以改善左室收缩功能和舒张功能、降低心肌缺血损伤大鼠的死亡率，还可减少心肌纤维原细胞的增生和肥大，减少脂质过氧化作用(Jiet al.，Eur J Pharmacol.2008，587：1-7)。在大鼠心肌缺血/再灌注模型中，缺血前15min预先给予NaHS能明显保护心脏功能，减少心肌梗死面积，抑制血管内皮细胞凋亡，促进内皮细胞再生(Bliksoen et al.，Eur J Cardiothorac Surg.2008，34：344-349)，说明硫化氢对缺血心肌具有保护作用。

防止动脉粥样硬化：研究表明，动脉粥样硬化的模型小鼠中血浆硫化氢水平明显降低，硫化氢浓度与动脉粥样硬化的严重程度具有明显相关性，腹腔注射NaHS后，血清中硫化氢的含量明显升高，主动脉根部动脉粥样硬化斑块明显缩小(王燕飞等.中国药理学通报.2008，24：1293-1296)，提示硫化氢可以延缓动脉粥样硬化的进程。