[发明专利]一种羊膜长期保存液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊膜保存液，尤其是一种羊膜长期保存液及其制备方法。

背景技术

羊膜(厚约0.02～0.05mm)来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织，由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成。羊膜在促进上皮修复、愈合及分化，抑制炎症，抗新血管生成，抑制纤维化及瘢痕化，防止睑球粘连等眼科多个领域发挥着重要的作用。随着羊膜用量的不断增加，羊膜的保存，尤其是羊膜活性成分的保存，成了当前眼科界研究的一个热点。

现在使用较为普遍的羊膜保存液为DMEM和甘油混合液(体积比为DMEM∶甘油＝1∶1)，将羊膜片放入装有DMEM和甘油混合液的容器中，密封置-70℃冰箱保存备用，该保存液会使羊膜上皮细胞形态有所改变，代谢酶活性和生长因子的表达有所降低，但过快的降温会造成细胞水肿，发生老化及功能减退，影响羊膜的品质。

申请号为200710150436.9、公开号为CN101444202A的专利申请公开了“一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用”，该新鲜羊膜保存液的组成及含量为：DMEM培养基9.0-12.0克，硫酸软骨素10.0-25.0克，透明质酸钠0.5-1.0克，HEPES4.0-5.0克，右旋糖苷10.0-15.0克，庆大霉素1.0-3.0毫升，地塞米松24.0-30.0毫克，非必需氨基酸10.0-15.0毫升，还原型谷胱甘肽0.50-0.95克，胎牛血清20.00-50.0毫升，注射用水加至1000毫升。该新鲜羊膜保存液具有在4℃冰箱中保存，将新鲜羊膜保存期延长20-30天的特点。但具有如下不足之处：该保存液中加入了血清成分，增加了病毒在羊膜与保存液之间传播的机会；成分以多种粘稠剂为主，只加入了0.9-1.2％的普通DMEM培养液作为保存液的成分，远没有达到保持羊膜细胞活性的需求；没有加入细胞营养成分，细胞很快会凋亡甚至坏死，只是稍稍延长羊膜保存时间；没有加入血管扩容剂，容易使羊膜细胞和组织肿胀，从而使羊膜细胞凋亡和胶原破坏；加入的地塞米松虽有促进细胞分裂与分化作用，但损耗了部分羊膜细胞的能量，影响羊膜细胞的存活，此外还可能浸附于羊膜的衬里，影响羊膜发挥作用。

发明内容

本发明目的是提供一种保存时间长、质量高、无污染、成本低的羊膜长期保存液，以及该羊膜长期保存液的制备方法。

本发明采用如下技术方案：

一种羊膜长期保存液，其特征在于：以1000ml保存液计，包括的组分为增稠剂10g～200g，血容量扩充剂10g～50g，氨基酸5ml～20ml，抗生素5ml～20ml，酸碱调节剂10ml～50ml，细胞稳定剂5ml～30ml，细胞营养成分5ml～20ml，培养液860ml-970ml。优选组分为增稠剂20g～100g，血容量扩充剂15g～35g，氨基酸10ml～15ml，抗生素10ml～15ml，酸碱调节剂25ml～35ml，细胞稳定剂15ml～20ml，细胞营养成分10ml～15ml，培养液900ml-930ml。

所述增稠剂为硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖中的至少一种，优选硫酸软骨素。硫酸软骨素是一种高分子物质，其大分子基团带有负电荷，可与羊膜上皮形成共价结合，从而在羊膜上皮表面形成一个保护层。实验证明这一保护层对羊膜上皮具有保护作用，可以显著地提高保存羊膜上皮和基质的活性。右旋糖酐也是一种高分子化合物。溶液中的硫酸软骨素与低分子右旋糖酐一起产生胶体渗透压，使得保存羊膜保持脱水状态，维持正常的羊膜厚度和韧性，有利于手术操作。

所述氨基酸为非必需氨基酸，非必需氨基酸为除8种必需氨基酸外的多种氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。

所述抗生素为庆大霉素、链霉素、妥布霉素等中的一种，最好采用妥布霉素。

所述酸碱调节剂为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES(英文名为2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，中文名为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为C8H18N204S)、硼酸-硼砂缓冲对中的一种，最好选用作用较强的HEPES。

所述血容量扩充剂为预胶化淀粉、羟乙基淀粉、糊精、甘露醇、山梨醇、木糖醇和乳糖中的至少一种。

所述细胞稳定剂为抗坏血酸、维生素E、SOD中的至少一种。