[发明专利]一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种快速高效DNA重组的方法包括以下两步：

(1).引物设计与PCR扩增：Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列。PCR扩增的条件一般为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是1min/1kb DNA)，30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物，因为模板DNA可能会被转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难，引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降；

(2).DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞：将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL-REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次。在电击杯中加入1mL复苏液(SOC培养基，0.1mM的MgCl₂溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。

2.一种快速高效DNA重组的试剂盒，其特征在于：由表达重组酶的感受态细胞、对照感受态细胞、标准样品、复苏液组成。

3.根据权利要求2所述的一种快速高效DNA重组的试剂盒，其特征在于：所述的重组酶的感受态细胞，由经IPTG诱导过的BL-REC工程菌制备，所述的BL-REC工程菌，由克隆有发光杆菌重组酶基因的pET32a质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成，所述的发光杆菌重组酶基因，由plu2935和plu2936基因组成的共表达框，所述的对照感受态细胞，由未经诱导的BL-REC工程菌制备，所述的标准样品，包括pUC19质粒和含同源序列的氯霉素抗性基因PCR产物组成，氯霉素抗性基因PCR产物，所述的pUC19质粒，200ng/μL的水溶液，所述的氯霉素抗性基因PCR产物，200ng/μL的水溶液，所述的复苏液，由SOC培养基和0.1mM MgCl₂溶液均匀混合而成。