[发明专利]一种比率型荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及过氧亚硝酸阴离子的测定技术，具体地说是一种基于稀土配合物的过氧亚硝酸阴离子比率型荧光探针及应用，是一种可用于生物体系中过氧亚硝酸阴离子选择性荧光测定的比率型稀土荧光探针。

背景技术

生物体系中的过氧亚硝酸阴离子(ONOO^-)是由一氧化氮(NO)和超氧阴离子自由基(O₂^-)迅速结合生成的一种重要的氮氧活性化合物。通常认为，ONOO^-是较NO和O₂^-氧化作用更强、作用更为广泛的一种强效细胞毒性物质(文献1：J.S.Beckman，T.W.Beckman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990，87，1620；文献2：G.Ferrer-Sueta，R.Radi，ACS Chem.Biol.2009，4，161)。作为一种强氧化剂，由于ONOO^-能产生细胞及组织的氧化损伤，因此与多种病症：如休克、急慢性炎症、败血症、外伤性局部缺血和动脉硬化等相关联(文献3：C.Szabo，H.Ischiropoulos，R.Radi，Nat.Rev.Drug Discov.2007，6，662)。同时，它还能氧化细胞膜、巯基官能团和酶、蛋白、脂质及DNA等生物大分子，是导致细胞损伤、能量耗竭和细胞死亡的重要因素。由于ONOO^-具有很高的运动性，可以很容易地穿透脂类双层，这使它不仅仅能破坏细胞，而且能渗透到附近的细胞，这些性质都加剧了ONOO^-对生物体的破坏作用。

为了从分子水平上认识ONOO^-对细胞、组织及整个生物体的氧化作用机制，上世纪90年代开始，生物化学家对于生物体系中ONOO^-的生成、代谢以及其病理损伤机理进行了大量研究。然而，由于在生物体内ONOO^-具有极强的反应活性和极短的存在时间(半衰期只有0.8s)，而且可与许多不同的化合物发生化学反应，生成各种各样的反应产物，这就给生物体系中ONOO^-的测定带来许多困难。目前，生物体系中ONOO^-的测定主要有以下两种方法：(1)基于ONOO^-与探针分子的反应所产生的信号变化来测定的方法，包括紫外-可见光度法、荧光法、电化学法和化学发光法(文献4：S.B.Digerness，K.D.Harris，J.W.Kirklin，Free Radic.Biol.Med.1999，27，1386；文献5：J.Xue，X.Ying，J.Chin，Anal.Chem.2000，72，5313；文献6：S.Dikalov，M.Skatchkov，E.Basseneg，Biochem.Biophys.Res.Commun.1997，230，54)；(2)通过测定ONOO^-与生物分子的反应产物来推测ONOO^-的方法，如测定蛋白质分子中酪氨酸硝化产物的方法(文献7：D.A.Richards，M.A.Silva，Anal.Biochem.2006，351，77)。上述方法中采用荧光分子探针的方法是一种简单、灵敏且特异的分析方法，到目前为止，已有几种荧光分子探针被成功用于ONOO^-的测定，如二氯二氢荧光素(DCFH)和二氢罗丹明(DHR)(文献8：H.Possel，H.Noack，FEBS Lett.1997，416，175；文献9：N.W.Kooy，J.A.Royall，Free Radic.Biol.Med.1994，16，149)，该方法虽有较高的灵敏度，但此类探针特异性较差，其它的生物氧化剂如次氯酸、巯基及过氧化酶也能氧化DCFH和DHR生成强荧光发光的二氯荧光素和罗丹明。近年来，两种基于芳环硝化和酮类氧化反应的新型ONOO^-荧光探针：NiSPYs和HKGreens，先后被合成了出来(文献10：T.Ueno，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2006，128，10640；文献11：D.Yang，H.Wang，J.Am.Chem.Soc.2006，128，600；文献12：Z.Sun，H.Wang，D.Yang，Org.Lett.2009，11，1887)，这两种探针可以与ONOO^-发生特异性反应而导致荧光强度的显著增强，但探针水溶性较差、易被光漂白、Stokes位移小，而且细胞内保留时间短，不利于细胞内过氧亚硝酸阴离子的长期观察和痕量测定。另外，目前已有的ONOO^-荧光探针都以荧光强度作为表征参数，虽然其操作简单，但是其结果的精确性却容易受外部环境和仪器条件变化如光学路径、光漂白、散射和背景光等因素的影响。而比率荧光法能较好地解决这些问题，该法是通过测量两个不同波长处的荧光强度，以其比值作为表征参数的一种测定方法，与传统的荧光探针相比，比率型荧光探针一般具有更高的选择性和灵敏度(文献13：H.Li，H.Yan，J.Phys.Chem.C 2009，113，7526)。