[发明专利]微生物叶面增效剂

权利要求书

1.微生物叶面增效剂，其特征在于：它的制备工艺流程路线如下：

(1)侧孢芽孢杆菌制剂的制备：菌种——试管斜面菌种培养——摇瓶菌种培养——种子罐深层液体发酵培养——封闭式固体发酵箱培养——侧孢芽孢杆菌制剂半成品——检测合格；

(2)弗氏链霉菌代谢物的制备：菌种——菌种诱变——试管斜面菌种培养——摇瓶菌种培养——种子罐液体发酵培养——发酵罐连续发酵培养——后处理——弗氏链霉菌代谢物半成品——检测合格；

(3)微生物叶面增效肥的制备：

发酵好的侧孢芽孢杆菌制剂确定活菌数，配制含量50～100亿/克侧孢芽孢杆菌制剂半成品和发酵好的弗氏链霉菌代谢物按重量比2～5％∶98～95％比例混配，然后检测、包装、制得成品。

2.根据权利要求1所述的微生物叶面增效剂，其特征在于：所述侧孢芽孢杆菌的培养基以及培养方式为以下任选一种：洋菜培养基培养、洋菜斜面培养基培养、J-肉汁培养液培养、明胶穿刺培养。

3.根据权利要求1所述的微生物叶面增效剂，其特征在于：所述侧孢芽孢杆菌制剂的生产工艺为：菌种——斜面菌种培养——摇瓶菌种培养——种子罐深层液体发酵培养——封闭式固体发酵箱培养——侧孢芽孢杆菌制剂半成品——检测合格，其中，种子罐发酵过程中的温度为32±1℃、通气条件1∶0.3～0.5V/V、发酵时间为18～20小时；封闭式固体发酵箱培养的条件为：湿度60％～90％、温度28～35℃、发酵时间为96～120小时。

4.根据权利要求1所述的微生物叶面增效剂，其特征在于：所述弗氏链霉菌代谢物的制备工艺：菌种——菌种诱变——试管斜面培养——摇瓶培养——种子罐液体发酵培养——发酵罐连续发酵培养——后处理——弗氏链霉菌代谢物半成品——检测合格；其中，种子罐液体发酵培养中的发酵温度为28±1℃、通气条件1∶0.5～0.8V/V、发酵时间为20～24小时；发酵罐连续发酵培养的条件为，发酵温度为28±1℃、通气条件1∶0.8～1.2V/V、发酵时间为40～48小时。

5.根据权利要求1所述的微生物叶面增效剂，其特征在于：弗氏链霉菌的斜面培养基为以下任选一种：察氏培养基、葡萄糖天冬素培养基、甘油天冬素培养基、无机盐淀粉培养基、ISP-2培养基、燕麦粉培养基、高氏一号培养基、桑塔氏培养基。

6.根据权利要求1所述的微生物叶面增效剂，其特征在于：所述工艺(2)弗氏链霉菌代谢物的制备中，菌种诱变方法如下：

(1)紫外线诱变

30瓦的紫外灯预热30分钟后，把盛有70ml用生理盐水制备的指标为5.7×10⁷个/ml的孢子悬液的玻璃缸置于紫外灯管30厘米处，玻璃缸下面放置磁力搅拌器，同时把无菌的转子放到玻璃缸中；开动搅拌器，开启紫外灯并记时，分别在0、5、10、15、20、30、40分钟定时取样10ml置于无菌离心管中备用；

(2)亚硝基胍诱变

称取一定量的亚硝基胍，用丙酮助溶，用pH6.0的磷酸盐缓冲液配制成20mg/ml的亚硝基胍母液，丙酮体积与缓冲液体积之比为1∶9；

在70ml用pH6.0的磷酸盐缓冲液制备成孢子数为5.7×10⁷个/ml的孢子悬液，在孢子悬液中加7ml亚硝基胍母液，置200RPM、28℃摇床处理；分别在作用0、5、10、15、20、25、30分钟后定时取样10ml于无菌离心管中3000RPM10分钟离心，生理盐水洗涤三次，最后用10ml生理盐水悬浮备用；

(3)硫酸二乙酯诱变

取1ml硫酸二乙酯用1ml丙酮助溶，加入70ml用pH7.0的磷酸盐缓冲液制备成的孢子数为5.7×10⁷个/ml的孢子悬液，置200RPM 28℃摇床处理；0、5、10、15、20、25、30分钟定时取样10ml于离心管中，每个离心管加入0.6ml36％的硫代硫酸钠终止反应，3000RPM10分钟离心，生理盐水洗涤三次，最后用10ml生理盐水悬浮备用和抑菌物质的高产菌多株；这些高产菌的抑菌活性分别是原始菌株的2-5倍。

7.根据权利要求1所述的微生物叶面增效剂，其特征在于：所述制备工艺(2)弗氏链霉菌代谢物的制备中，其后处理过程为发酵液通过固液分离，固体部分采用闪蒸法干燥，液体部分采用喷雾法干燥，合并干粉为弗氏链霉菌代谢物。