[发明专利]一种红细胞代用品的制备方法

说明书

一种红细胞代用品的制备方法，本发明的特征是取消了纯化红细胞内容物的步骤，用红细胞内容物直接聚合血红蛋白；与现有技术相比：本发明制备的红细胞代用品具有较强的抗氧化性能，故使保质期延长三倍以上；同时保留了红细胞较为完整的功能；由于减少了血红蛋白纯化的步骤，在制备中对温度条件的要求降低，使制备过程简单，缩短了生产周期，降低了生产成本；经动物对比实验观察，所制备的产品有降低不良反应的作用；本发明制备方法适用于采用聚合血红蛋白方式制备红细胞代用品。

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种以人或动物来源的血液制备红细胞代用品。

背景技术

输血在临床手术、抗灾、恐怖袭击和战地救护中都是非常重要的医疗手段，目前主要是靠人们献血来满足需求。由于人类的血型复杂，输血时必须进行配型，并且血液的储存期短、运输不便、来源有限，还存在有艾滋病、乙肝等病毒传染的潜在危险，这些都使得血液在突发事件的紧急救护受到限制，尤其是紧急状态的大量使用。近年来，随着血液需求量的不断增高，仅靠人类自身献血很难满足日益增长的需求，因此开发安全有效的血液代用品对于缓解上述问题有着重要的意义。

血红蛋白具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂用于代替红细胞的功能研究，具有潜在的临床应用价值，由血红蛋白制备的代替红细胞功能的制剂被称为血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-based oxygencarriers，HBOCs)，亦被称为红细胞代用品；其具有能够被消毒、容易储存、无需交叉配型的特点，特别适合于突发事件中的紧急使用。这种制剂主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。在稳定血红蛋白四聚体的试剂中，常用的是多醛基化合物(如戊二醛)；血红蛋白有40个左右的赖氨酸的氨基暴露在血红蛋白表面，多醛基分子可以与这些氨基反应，形成不均一的聚合物分子。

在现有的制备方法中，都是将红细胞溶胀，得到细胞内容物(即红细胞膜内的全部物质)，再将内容物纯化，去除其中除血红蛋白以外的蛋白，纯化的目的是尽可能地降低红细胞代用品的免疫原性。美国专利5,895,810记载了一种用戊二醛交联血红蛋白制备红细胞代用品的方法，其中所用的血红蛋白为被纯化的高纯度血红蛋白。据报道，采用这种血红蛋白制备的红细胞代用品，在临床实验中有血压升高、腹痛、恶心、头晕、心肌梗死、自由基导致的氧化应激损伤等多种不良反应；在制备过程中该制品也非常容易造成不具有载氧能力的高铁血红蛋白升高，也会使有效期缩短。

本申请人研究发现，这种红细胞代用品的使用，所出现的不良反应与血红蛋白的高纯度有关。原因在于红细胞中许多内容物间有一系列的平衡关系，在经过纯化后，这种平衡被全部破坏，功能较为单一；最为明显的例证就是抗氧化系统，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是抗氧化系统中最重要的酶，经测定，在血红蛋白纯化前SOD和CAT的活性分别为8,000～30,000U/g和30,000～150,000U/g；而纯化后，其活性分别在0～150U/g和0～300U/g之间，其抗氧化功能的丧失，导致后续生产需在低温条件下进行，条件较为苛刻，成本升高，有效期也相应缩短。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提出一种红细胞代用品的制备方法，使所制备的红细胞代用品在临床应用中能够减轻和消除所出现的不良反应，并克服生产制备中所要求的苛刻条件。

目前，红细胞代用品的制备方法为：①在血液中加入抗凝剂进行抗凝，离心或超滤去除血浆蛋白和白细胞，进行红细胞的纯化；②用低渗盐对红细胞进行低渗，使红细胞的内容物释放出来；③用层析或巴氏灭活的方法对红细胞的内容物进行纯化，得到高纯度血红蛋白；④用交联剂将血红蛋白聚合，得到血红蛋白聚合体的混合物；⑤用凝胶过滤或超滤方法去除未聚合的血红蛋白，并置换载体溶液，得到红细胞代用品。本发明的特征在于，取消现有技术中纯化红细胞内容物的步骤，用红细胞内容物直接聚合血红蛋白。所制备的红细胞代用品拥有红细胞内容物的大部分理化功能；为了增加和增强红细胞代用品的其它功能，还可以向红细胞内容物中加入相应的蛋白质。

本发明所提出红细胞代用品制备方法的具体步骤包括：