[发明专利]新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、编码它们的基因、及其产品和应用。更具体地，本发明涉及以最优量生产PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情况下对自催化活性敏感的异源多肽。更具体地，本发明涉及融合蛋白，其包括异源多肽，例如融合于脂肪酶信号序列的丝氨酸蛋白酶，其可通过重组宿主细胞以期望量表达。本发明还涉及编码此类融合蛋白的多核苷酸、涉及用于表达此类融合蛋白的表达载体、涉及用此类多核苷酸/载体转化的宿主细胞、以及涉及生成此类融合蛋白的方法。

背景技术

胰蛋白酶是一种高价值的蛋白酶，其具有很多工业和生物医学应用。持续增长的对具有特殊性能的非动物源的胰蛋白酶的需求已经促进关注在微生物中克隆和表达蛋白酶。由于与蛋白表达和自催化性能相关的困难，有关重组胰蛋白酶表达的报告在成功程度上有很大的差别。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)似乎是生产胰蛋白酶最具潜力的微生物宿主。

胰蛋白酶是～25kDa的丝氨酸蛋白酶，由胰腺的腺泡细胞以无活性的前体-胰蛋白酶原分泌。激活肽氨基酸DDDDK在成熟胰蛋白酶中出现在胰蛋白酶原前面，其由肠激酶在肠道中切割。激活的胰蛋白酶将在可及精氨酸(R)和赖氨酸(K)氨基酸残基的羧基端切割蛋白。胰蛋白酶不仅消化包含可及R和K的任何蛋白，而且作用于其自身序列的可及R和K并降解本身(自催化活性)。因此在微生物或哺乳动物系统中生产重组胰蛋白酶是一个非常大的挑战。并且表达水平非常低。为克服该问题，本发明的发明人已将97个氨基酸的米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶信号序列融合至牛胰蛋白酶原并在巴斯德毕赤酵母中表达。脂酶原序列的存在稳定了胰蛋白酶原的表达并且似乎防止了体内的活化。

脂酶原作为脂肪酶的N端延伸物，与信号序列不同，信号序列是输送蛋白进入或穿过细胞膜，或分泌进入细胞外基质所必要的。米根霉脂肪酶的69个氨基酸前肽区(propeptide region)在26-氨基酸信号序列之后。现有研究显示脂酶原区中的突变(C56至S)减缓脂肪酶的折叠(Beer H.D.，Wohlfahrt G.，Schmid R.D.，McCarthy J.E.G.，Biochem.J.319：351-359，1996)。用来自于米根霉脂肪酶的脂酶原区替换天然的牛胰蛋白酶原的前区(前肽，propeptide)，惊人地促进了重组牛胰蛋白酶原的稳定性和产量。

现有的技术状态未能提供一种可接受的令人满意的/理想的生产方法，能在合适的宿主细胞中表达异源融合多肽的可纯化形式。

因此广泛认为需要一种没有以上限制的方法，并且有这种方法是非常有利的。

本发明的改进的新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白克服了以上讨论的和现有技术中的许多其他缺点和不足。

发明内容

本发明的目的

本发明的主要目的是获得融合多肽，该融合多肽包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶。

本发明的另一个主要目的是获得一种表达融合多肽的方法。

本发明的又一个目的是获得包括上述序列的载体。

本发明的再一个目的是获得转化细胞，该转化细胞包括上述的可表达方式的序列。

本发明的陈述

因此，本发明涉及一种融合多肽，包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母(methyloptropic yeast)中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：1至少80％同源性的氨基酸序列；融合多肽包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：2至少80％同源性的核苷酸序列；一种表达融合多肽的方法，包括由甲基营养酵母生产的融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有与SEQ ID No 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列至少80％同源性的核苷酸序列；一种包括上述序列的载体；以及一种包括上述的可表达形式的序列的转化细胞。

附图说明

图1：脂酶原的PCR扩增产物以及牛胰蛋白酶原编码序列。

图2：融合的PLBTR扩增的PCR产物。

图3：通过使用XbaI和BamHI限制酶切分析来筛选阳性克隆。

图4：A、分析从不同克隆获得的脂酶原牛胰蛋白酶原。

B、使用胰蛋白酶原抗体的SDS PAGE和蛋白印记