[发明专利]通过红细胞生成素(EPO)天然反义转录物的抑制对EPO相关疾病的治疗

说明书

优先权声明

本申请要求于2008年12月4日提交的题为“RNA Molecules Targeting Erythropoietin and Related Molecules(靶向红细胞生成素及相关分子的RNA分子)”的美国临时专利申请序列号61/119,961的权益，上述申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明的实施方案包括调节EPO及相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。

背景

DNA-RNA和RNA-RNA杂交对包括DNA复制、转录和翻译在内的核酸功能的许多方面是重要的。杂交对检测特定核酸或者改变其表达的各种技术也是重要的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交而破坏基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反义DNA具有的额外特征是DNA-RNA杂合体作为核糖核酸酶H消化(大多数细胞类型中存在的活性)的底物。反义分子可被递送到细胞中，如寡脱氧核苷酸(ODN)的情况，或者它们可作为RNA分子从内源基因表达。FDA最近批准了反义药物VITRAVENE^TM(用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，反映出反义物具有治疗效用。

激素红细胞生成素(EPO)介导的增强的红细胞产生是人对低氧的公知适应性应答(Bunn等(1996)Physiological Rev.76,839-845)。通常由成人肾脏和胎儿肝脏产生的EPO刺激骨髓中表达红细胞前体的EPO受体(EpoR)的发育。

EPO是由肾的肾间质细胞产生的糖蛋白(46kDa)激素，其调节骨髓中红细胞的产生。这些细胞对低动脉氧浓度敏感，在氧少(低氧)时将释放红细胞生成素。红细胞生成素刺激骨髓产生更多红细胞，从而提高血液的载氧能力。EPO通过结合骨髓中红细胞前体表面上的EpoR而发挥其作用。但是，已在除肾间质细胞外的来自其他正常组织的细胞(包括肠细胞、滋养层和神经元细胞)上观察到EPO表达。

血流中EPO的测量可表明骨髓障碍或肾疾病。红细胞生成素的正常水平是0-19mU/ml(毫单位/毫升)。水平升高可见于真性红细胞增多症，这是以脾肿大和骨髓产生红细胞增多为特征的病症。低于正常值见于引起贫血的慢性肾衰竭。慢性肾衰竭在某种程度上导致贫血，因为逐渐缺乏用于维持红细胞生成的足够EPO产生。

低氧是实体瘤的主要特征，实体瘤占全部人类癌症的大约90％。实体瘤中低氧的适应性应答与侵占性增强、肿瘤细胞死亡减少和肿瘤对放射疗法和化学疗法的反应降低有关。已在不同的造血和非造血恶性肿瘤中观察到EPO表达，且已表明其介导表达EpoR的红细胞白血病细胞的自主生长。

许多常见人类癌症过表达低氧诱导的转录因子HIF-1，其调节EPO以及增强癌细胞低氧存活所需的若干基因的表达，这些基因包括编码糖酵解酶、葡萄糖转运蛋白和血管内皮生长因子的基因(Semenza(1999)Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.15,551-578)。肿瘤低氧被认为是肿瘤对化学疗法和放射疗法的抗性中的主要因素，但其潜在机制未知。低氧主要通过激活受低氧诱导因子-1(HIF-1)调节的若干基因的表达而在细胞中诱导适应性应答，HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的异源二聚体转录因子。

概述

该概述被提供用于介绍本发明的概要，以简要说明本发明的性质和实质。它被提出的条件是，它不用来解释或限制权利要求的范围或含义。

在一个实施方案中，本发明提供用于抑制天然反义转录物的作用的方法，其通过利用靶向天然反义转录物的任何区域的反义寡核苷酸导致上调相应有义基因来进行。本文还预期，天然反义转录物的抑制可通过被认为落入本发明范围内的siRNA、核酶和小分子来完成。

一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸或其它基因产物的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包含SEQ ID NO:3(图4)的第1-156个核苷酸中的5-30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，从而体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸的功能和/或表达。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向EPO多核苷酸的天然反义序列(例如SEQ ID NO:3所示的核苷酸)及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO:4-6(图5)所示。