[发明专利]RNA展示的改良方法

说明书

相关申请

本申请要求于2008年9月30日提交的美国临时申请号61/101471的优先权，其内容在此引入作为参考。

发明领域

本公开内容涉及RNA展示，且具体涉及允许选择可溶性和细胞表面抗原的RNA展示方法。

发明背景

可以选择以高特异性和亲和力与几乎任何结构表位结合的抗体且将其常规用作研究工具和FDA批准的治疗剂。因此，治疗用和诊断用单克隆抗体构成全世界数十亿美元的市场。

使动物免疫接种以获得抗体的传统方法是缓慢且麻烦的。因此，已开发了使用合成抗体文库用于先体外后体内选择针对所需靶分子的抗体的方法。在一些方法中，抗体或其片段的文库展示在生物的表面上，（例如，噬菌体、病毒、酵母细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞），并且就所需抗体的表达选择生物。在其他方法中，在无细胞体外系统中表达且选择抗体文库。在称为RNA展示的一个此种系统中，所表达的蛋白质或肽与其编码mRNA共价或通过紧密的非共价相互作用连接，以形成RNA/蛋白质融合分子。可以就与所需靶的结合选择RNA/蛋白质融合物的蛋白质或肽组分，并且通过测序所附着的编码mRNA组分来测定蛋白质或肽的特性。

目前的体外RNA展示系统尽管善于表达单个抗体可变结构域，但在表达多结构域抗体例如单链抗体（scFv）分子方面无效。这主要是由于目前的体外表达系统的反应条件和通过经由PCR的反复扩增丧失来自文库的全长scFv cDNA的趋势。

因此，本领域需要改良的体外展示方法用于选择针对所需靶的scFv抗体。

发明概述

本发明通过提供改良的体外RNA展示方法解决了前述问题，以允许从表达文库中可靠表达和选择scFv分子。尽管特别适合于表达和选择scFv分子，但本发明的方法对于所有类别蛋白质的体外展示也是有利的，包括可溶性和细胞表面抗原。

因此，本发明具有几个优点，这包括但不限于提供改良的体外RNA展示方法，其执行比先前描述的方法更简单且更不耗时。此外，本发明的方法允许含链内二硫键的蛋白质例如scFv抗体分子增强的功能表达。

在一个方面，本发明提供了筛选scFv抗体RNA展示文库的方法，该方法包括步骤（a）提供嘌呤霉素或其类似物交联的scFv mRNA分子，所述分子包括编码5’ scFv和3’间隔区序列的mRNA，所述分子与单链核酸接头交联，所述接头包括在3'末端上的嘌呤霉素或其类似物和在5'末端上的补骨脂素C6；（b）在标记的存在下，在GSSG（氧化谷胱甘肽）/GSH（还原谷胱甘肽）和PDI（蛋白质二硫键异构酶）的存在下和在不存在二硫苏糖醇的情况下，在使得形成标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子的条件下，体外翻译嘌呤霉素交联的scFv mRNA；（c）纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子；（d）用至少一种抗原对纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子实施抗原选择；和（e）使用基于亲和力的磁珠回收纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。

在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤（g）在抗原选择后使scFv mRNA逆转录，以制备cDNA。在另一个实施方案中，该方法进一步包括步骤（h）扩增cDNA。

在一个实施方案中，标记是放射性标记，例如³⁵S甲硫氨酸或半胱氨酸。

在一个实施方案中，3'间隔区序列包括约0 – 约200个氨基酸，例如约16个氨基酸，和/或3'间隔区包括亲和标记。

在一个实施方案中，接头从5'到3'包括：补骨脂素C6、包括序列UAGCGGAUGC（SEQ ID NO：20）的2'OMe核糖核苷酸、6个三甘醇或PEG-150部分、2个胞苷残基和嘌呤霉素。

在一个实施方案中，scFv mRNA分子通过UVA与DNA接头光交联。在另一个实施方案中，scFv mRNA分子包括选自T7、SP6和T3的5'启动子。在具体实施方案中，scFv mRNA分子包括烟草花叶病毒5'非翻译区。

在一个实施方案中，通过寡脱氧胸苷酸层析纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。在另一个实施方案中，使用抗FLAG M2单克隆抗体琼脂糖珠纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。在另外一个实施方案中，通过寡脱氧胸苷酸层析和抗FLAG M2单克隆抗体琼脂糖珠纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。