[发明专利]RNA展示的改良方法

权利要求书

1.一种筛选scFv抗体RNA展示文库的方法，所述方法包括步骤：

（a）提供嘌呤霉素或其类似物交联的单链Fv（scFv）mRNA分子，所述分子包括编码5’ scFv和3’间隔区序列的mRNA，所述分子与单链核酸接头交联，所述接头包括在3'末端上的嘌呤霉素或其类似物和在5'末端上的补骨脂素C6；

（b）在标记的存在下，在使得形成标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子的条件下，体外翻译所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA；

（c）纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子；

（d）用至少一种抗原对所述纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子实施抗原选择；和

（e）使用基于亲和力的磁珠回收所述纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。

2.权利要求1的方法，其进一步包括步骤（g）在抗原选择后使所述scFv mRNA逆转录，以制备cDNA。

3.权利要求2的方法，其进一步包括步骤（h）扩增所述cDNA。

4.利要求1的方法，其中所述标记是放射性标记。

5.利要求4的方法，其中所述标记是³⁵S甲硫氨酸或半胱氨酸。

6.利要求1的方法，其中所述3'间隔区序列包括约0 – 约200个氨基酸。

7.利要求1的方法，其中所述3'间隔区序列包括约16个氨基酸。

8.利要求1的方法，其中所述3'间隔区序列包括亲和标记。

9.权利要求1的方法，其中所述核酸接头从5'到3'包括：  

- 补骨脂素C6；

- 包括序列UAGCGGAUGC（SEQ ID NO：20）的2'OMe核糖核苷酸；

- 6个三甘醇或PEG-150部分；

- 2个脱氧胞苷残基；和

- 嘌呤霉素。

10.权利要求1的方法，其中所述scFv mRNA分子通过UVA与所述DNA接头光交联。

11.权利要求1的方法，其中所述scFv mRNA分子包括选自T7、SP6和T3的5'启动子。

12.权利要求1的方法，其中所述scFv mRNA分子包括烟草花叶病毒5'非翻译区。

13.权利要求1的方法，其中通过寡脱氧胸苷酸层析纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。

14.权利要求1的方法，其中使用抗FLAG M2单克隆抗体琼脂糖珠纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。

15.权利要求1的方法，其中通过寡脱氧胸苷酸层析和抗FLAG M2单克隆抗体琼脂糖珠纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。

16.权利要求1的方法，其中所述抗原是生物素化肽、蛋白质或半抗原。

17.权利要求1的方法，其中所述抗原是具有人免疫球蛋白可结晶片段（Fc）的融合蛋白。

18.权利要求1的方法，其中所述抗原是具有鼠免疫球蛋白可结晶片段（Fc）的融合蛋白。

19.权利要求1的方法，其中所述抗原是生物素化肽、蛋白质或半抗原。

20.权利要求1的方法，其中所述抗原是细胞群体。

21.权利要求1的方法，其中所述抗体是抗IL-12抗体。

22.权利要求1的方法，其中所述抗体是抗HA抗体。

23.权利要求1的方法，其中所述抗体是鼠抗体。

24.权利要求1的方法，其中所述抗体是人抗体。

25.权利要求1的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

26.权利要求1-24中任一项的方法，其中另外在GSSH/GSH的存在下执行所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA的体外翻译。