[发明专利]产生L-氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用细菌产生L-氨基酸的方法。L-氨基酸在工业上可用作动物饲料添加剂、健康食物成分、氨基酸输液等。

背景技术

使用微生物通过发酵生产目标物质如L-氨基酸的方法包括使用野生型微生物(野生型菌株)的方法，使用来源于野生型株的营养缺陷型菌株的方法，使用来源于野生型菌株的耐受多种药物的代谢调节突变体菌株的方法，使用兼具营养缺陷型菌株和代谢调节突变体菌株两者性质的菌株的方法等。

近年来，重组DNA技术用于通过发酵产生目标物质。例如，微生物的L-氨基酸生产力可通过增强编码L-氨基酸生物合成酶的表达(专利文献1和2)或通过增强L-氨基酸生物合成系统对碳源的摄入(专利文献3)来提高。

同时，公开了在发酵生产碱性氨基酸的过程中利用碳酸根离子和碳酸氢根离子作为碱性氨基酸的反荷阴离子(counter anion)来替代一部分硫酸根离子或氯离子。作为将碳酸根离子和碳酸氢根离子添加至培养基的方法，这些文献描述了控制发酵罐内部压力在发酵过程中为正压，或向培养基供应二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体的方法(专利文献4和5)。

L-天冬氨酸家族氨基酸如L-赖氨酸的常规氨基酸发酵受L-谷氨酸副产物产生的影响，具体而言，如上所述的发酵生产在高pH的条件下有特别显著的L-谷氨酸副产物生成的问题。因为在许多情况下在L-氨基酸生产工艺中必需在发酵生产之后将L-氨基酸纯化至高纯度，副产物的存在是不期望的，其可招致复杂的纯化工艺和产物纯度降低的问题。

迄今为止，作为发现在肠细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)中涉及谷氨酸摄入的蛋白质，已知有GltP、GltS(非专利文献1和2)、GadC(非专利文献3)和GltIJKL。

已知在经修饰增强谷氨酸脱羧酶活性的菌株中L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸的生产力通过增强谷氨酸/GABA反向转运蛋白的活性(专利文献6)而得到增强。然而，并无使用其中gltP基因或gltS基因扩增的微生物产生L-氨基酸的报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利5,168,056号

专利文献2：美国专利5,776,736号

专利文献3：美国专利5,906,925号

专利文献4：美国专利申请公开2002/0025564号

专利文献5：国际专利公开WO2006/038695

专利文献6：国际专利公开WO2008/044453

非专利文献

非专利文献1：J.Bacteriol.，1992Apr；174(7)：2391-3

非专利文献2：J.Biol.Chem.，1990Dec；15；265(35)：21704-8

非专利文献3：J.Bacteriol.，2006Dec；188(23)：8118-27

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的一个目标是提供属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，能够在选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的氨基酸的生产中减少副产物L-谷氨酸产生的微生物，以及提供通过使用如上所述的可在氨基酸生产中减少副产物L-谷氨酸产生的微生物来生产如上所述的L-氨基酸的方法。

解决问题的手段

本发明的发明人为实现前述的目标进行了多方研究，结果发现，通过修饰细菌以增加gltP和/或gltS的表达，能够减少L-氨基酸的发酵生产中作为副产物产生的L-谷氨酸，从而完成了本发明。

因此，本发明提供了下述：

1.一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸产生能力的细菌以在培养基中产生和累积所述L-氨基酸，并从培养基收集所述L-氨基酸，其中：

所述细菌已经过修饰从而增加了gltP基因和/或gltS基因的表达，且所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。

2.如上所述的方法，其中所述gltP基因编码下述(A)或(B)所示的蛋白质：

(A)具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，

(B)具有在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。