[发明专利]用于治疗糖尿病的源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞

权利要求书

1.用于从人脂肪组织中分离和分化胰岛素生产性间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

a)将脂肪组织切成碎末，

b)向上述组织中加入1型胶原酶，

c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，

d)将步骤c获得的全部内含物离心，

e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿中在37℃和CO₂气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的Eagles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真菌剂组成，

f)更新培养基但不进行连续传代，

g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，

h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数以及CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的流式细胞术分析，

i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞，所述分化培养基由DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h)B27、N2、血清添加物、抗生素和抗真菌剂组成，

j)在至少3天后，使用常规技术分离步骤(i)的细胞，而后进行Pax-6、Isl-1、Ipf-1/pdx-1、C-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。

2.权利要求1的方法，其中人白蛋白的浓度优选为20％。

3.权利要求1的方法，其中所述成纤维细胞生长因子的浓度优选为5mg/ml

4.权利要求1的方法，其中所用抗生素为青霉素、链霉素与头孢噻肟的组合。

5.权利要求1的方法，其中所用抗真菌剂为氟康唑。

6.权利要求1的方法，其中所述细胞分离通过以下来实现：在离心管中装入聚蔗糖泛影葡胺，将培养基及漂浮细胞铺层在聚蔗糖泛影葡胺上，离心并吸出白色细胞环，并用缓冲液清洗。

7.治疗糖尿病的方法，其通过向糖尿病患者施用源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞来实现，所述细胞通过包括以下步骤的过程分离和分化；

a)将脂肪组织切成碎末，

b)在上述组织中加入1型胶原酶，

c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，

d)将步骤c获得的全部内含物离心，

e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿中在37℃和CO₂气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的Eagles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真菌剂组成，

f)更新培养基但不进行连续传代，

g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，

h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数并进行CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的流式细胞术分析，

i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞但不进行连续传代，所述分化培养基由DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h)B27、N2、血清添加物、抗生素和抗真菌剂组成，

j)在至少3天后，使用常规技术分离来自早先步骤的细胞，而后进行Pax-6、Isl-1、Ipf-1/pdx-1、C-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。

8.权利要求7的方法，其中培养基中所用人白蛋白的浓度优选为20％。

9.权利要求7和8的方法，其中培养基中成纤维细胞生长因子的浓度优选为5mg/ml。

10.权利要求7至9的方法，其中所用抗生素组合由青霉素、链霉素和头孢噻肟组成。

11.权利要求7至10的方法，其中所述细胞分离通过以下来实现：在离心管中装入聚蔗糖泛影葡胺，将培养基及漂浮细胞铺层在聚蔗糖泛影葡胺上，离心并吸出白色细胞环，并用缓冲液清洗。

12.权利要求7至11的方法，其中所述从脂肪组织中获得的间充质干细胞与造血干细胞一起施用给患者。

13.权利要求7至12的方法，其中输注所述干细胞，优选输注到患者的门脉循环中。