[发明专利]提高目标蛋白质的表达产率的方法

说明书

序列表索引

本申请含有计算机可读形式的序列表。本文以提述方式并入该算机可读形式。

发明背景

发明领域

本发明涉及提高目标蛋白质的表达产率的方法。本发明特别涉及分离的多肽和编码本发明多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产和使用所述多肽的方法。

相关技术的描述

近年来重组宿主细胞在异源蛋白质表达中的应用大大简化了许多原本只能从其天然来源纯化的具有商业价值的蛋白质的大量生产。目前，多种表达系统可供选择用于任何蛋白质的生产，包括细菌和真核宿主。合适的表达系统的选择往往不但取决于宿主细胞产生足够产率的活性状态的蛋白质的能力，而且可能在很大程度上还由该蛋白质预期的最终用途所决定。

典型地，借助下列手段已经获得了产率的改善：通过使用不同的蛋白酶突变体来改善蛋白质产物的稳定性；或者通过使用强启动子来控制表达而增加表达量，或者通过使用最高效的信号肽来改善分泌途径。

一直用于异源蛋白质表达的宿主细胞处于应激状态下，因为蛋白质合成体系将被迫达到极限(Rutkowski，D.T.，and Kaufman，R.J.(2004)，”A trip tothe ER：coping with stress”，Trends in Cell Biology 14(1)：20-28)。因此，可以通过有利地操纵与应激反应相关的蛋白质来实现蛋白质产物的产率提高。

本发明的一个目的是提供这样的多肽，其表达在应激条件下被提高或诱导，以及提供通过修饰表达来提高收率的方法。

发明内容

本发明涉及选自下组的分离的多肽：

(a)包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少66％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，进一步更优选至少85％，最优选至少90％，进一步最优选至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由下述多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少中等严紧条件下，进一步优选至少中-高严紧条件下，最优选至少高严紧条件下与(i)SEQID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的DNA序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由下述多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，进一步更优选至少85％，最优选至少90％，进一步最优选至少95％同一性的核苷酸序列；

(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含一个或多个(数个)氨基酸取代、缺失和/或插入的变体。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞以及生产本发明的多肽的方法。

本发明的另一个方面涉及一种生产本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收该多肽。

本发明的另一个方面涉及一种生产本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码所述多肽的核苷酸序列的核酸构建体，和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及一种突变体真菌宿主，其中该突变体中选自下组的内源多肽的表达降低或无表达：

(a)包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少66％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，进一步更优选至少85％，最优选至少90％，进一步最优选至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由下述多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少中等严紧条件下，进一步优选至少中-高严紧条件下，最优选至少高严紧条件下与(i)SEQID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的DNA序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由下述多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，进一步更优选至少85％，最优选至少90％，进一步最优选至少95％同一性的核苷酸序列；

(d)在凋亡过程中被诱导，且包含基序：