[发明专利]用胶体金免疫层析试验检测伏马毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，具体是一种用胶体金免疫层析试验检测伏马毒素的方法。

背景技术

伏马毒素(Fumonisins)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。伏马毒素能够对玉米及其制品造成污染，而且在以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品，甚至在芦笋中也检测到了伏马毒素。据报道，伏马毒素与马脑白质软化症，猪的肺水肿症候群，大鼠肝癌等疾病有关。除上述疾病外，在南非的特兰斯凯地区和中国林县地区研究发现，食用伏马毒素污染的玉米制品与人类食道癌相关。串珠镰刀菌产生的毒素已经被国际癌症研究会(International Agency for Research on Cancer，IARC)划分到2B类--可能的人类致癌物。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马毒素检测方法。

胶体金免疫层析试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的胶体金标记。固定在NC膜上的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，胶体金标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又有示踪的功能。在测定时，通常受检样品(测定其中的抗体或抗原)通过毛细作用向前移行与金标垫上的抗原或抗体起反应。继续向前移行，与固定在T线(检测线)抗原或抗体结合形成免疫复合物被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带，多余的金标抗体继续向前移动，与固定在C线(质控线)的二抗结合被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带。此时T线形成金标复合物与标本中受检物质的量呈一定的比例，故可根据T线呈现的颜色深浅进行定性或半定量分析。

关于伏马毒素的检测国内外已建立了多种方法。目前检测伏马毒素的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，在全球范围内的玉米及其制品的调查中，90％以上的实验室用的都是HPLC法。由于伏马毒素本身既没有特异的紫外吸收基团，同时也没有荧光特性，但在一定条件下伏马毒素可同某些物质反应形成具有荧光的衍生物，因此荧光衍生剂和衍生方法的选择与HPLC检测伏马毒素的准确度和灵敏性有密切关系。此外该法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用胶体金免疫层析试验快速检测伏马毒素的方法。本发明的方法检测特异性强，准确率高；检测速度快，所需时间短，只需5～10分钟。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括具体步骤如下：

步骤一，将伏马毒素半抗原通过戊二醛法分别与KLH(血蓝蛋白)和OVA(卵清白蛋白)偶联；

步骤二，利用步骤一所得伏马毒素-KLH偶联物，采用常规方法制备抗伏马毒素的单克隆抗体；

步骤三，用柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，用该胶体金标记经过透析除盐处理的抗伏马毒素的单克隆抗体；

步骤四，将步骤三得到的单克隆抗体蛋白喷涂到金标垫上，将伏马毒素-OVA偶联物喷涂到T线，兔抗鼠的单克隆抗体喷涂到C线，组装成试纸条，干燥；

步骤五，将待测样品用甲醇提取，离心，取上清，将上清滴入试纸条的样本槽中，获取T线和C线的显色，鉴定，得到结果。

步骤三中，所述胶体金的制备方法具体为：将100ml的0.005％HAuCl₄溶液加热至沸腾，之后加入0.5～1ml的1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸7～10min，最后加三蒸水至100ml，制备得到40nm的胶体金溶液；其中，百分数为重量体积百分数。

步骤三中，所述标记具体为：在搅拌的条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其终浓度达到40ug/mL，25℃下孵育5min，用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH为9.0，然后加入10％BSA至BSA的终浓度为0.1％，10000rpm离心20min，弃上清，再用0.01mM pH为9.0的Tris缓冲液恢复，重复1次，之后将沉淀重悬于原体积的1/10的0.01mM pH为9.0的Tris缓冲液中，最后加入10％BSA至BSA的终浓度为0.1％，4℃储存备用；其中，百分数为重量体积百分数。

步骤四中，所述干燥为37℃烘箱干燥。