[发明专利]一种间充质干细胞的保存方法和培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学和低温医学技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的保存方法和培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)在发育生物学研究和临床治疗，如组织和器官修复等方面具有广阔的应用前景(Blood，102，3483-3493，2003)。MSCs最先在骨髓中确认其存在，随后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪组织等均发现有MSCs存在。MSCs属于多能干细胞，在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型的细胞(Science，284，143-147，1999)。脐带是来源丰富的正常分娩废弃物，其含有丰富的MSCs。最近已有多篇有关从脐带中分离MSCs的报道(StemCells，22，1330-1337，2004；Stem Cells，25，1384-1392，2007)。脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)具有多向分化能力和免疫抑制调节能力，在再生医学和细胞治疗方面具有广泛的用途(Stem Cells，25，2017-2024，2007)。如在出生时就储存自己的脐带间充质干细胞，则在日后的应用中就不存在免疫排斥的难题。

现有储存自体UC-MSCs的方法为采集新鲜的脐带后，立即消化培养MSCs，扩增获得一定数量的细胞后进行冻存。这个扩增培养过程需要15到30天，且消耗大量的昂贵培养液和人力。如果日后没有应用，还造成浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞的保存方法，以克服现有技术中储存脐带间充质干细胞之前必需进行扩增的限制。

用于实现本发明的上述目的的技术方案如下：

一种间充质干细胞的冻存液，该冻存液为包含50％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清、18.6％(体积/体积；mL/mL)的DMSO、15.4％(质量/体积；g/mL)的乙酰胺、9.0％(体积/体积；mL/mL)的1，2-丙二醇、4.0％(质量/体积；g/mL)的聚乙二醇的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

一种间充质干细胞的保存方法，该方法包括以下步骤：

(1)将脐带组织切割成块，置于体积比为1∶3(mL∶mL)的上述冻存液与基础液的混合溶液中预处理；

(2)将脐带组织块转移至体积比为1∶1(mL∶mL)的上述冻存液与基础液的混合溶液中，0℃下处理；

(3)将脐带组织块转移至上述冻存液中，0℃下处理；

(4)将脐带组织块在液氮中冻存，

其中所述基础液为包含50％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

在上述保存方法中，优选地，脐带组织块的体积小于2mm³。优选地，所述步骤(1)中的预处理时间为10～25分钟，例如15分钟；所述步骤(2)中的处理时间为5～15分钟，例如10分钟；所述步骤(3)中的处理时间为5～15分钟，例如10分钟。优选地，所述冻存过程中脐带组织块与冻存液的质量体积比均为1∶4(g/mL)。

利用上述冻存方法可以将脐带直接进行玻璃化冻存至深低温-196℃并保持其中大部分细胞的生命活力，复苏该玻璃化冻存脐带组织可以从中快速培养出脐带间充质干细胞并扩增。

本发明的另一个目的是提供一种间充质干细胞的培养方法。

用于实现本发明的上述目的的技术方案如下：

一种间充质干细胞的完全培养液，该完全培养液为包含10～20％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清，100U/mL的青霉素，100U/mL链霉素，2ng/mL的两性霉素B，2～5mmol/L的L-谷氨酰胺和20mmol/L的羟乙基呱嗪乙硫磺酸的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

本发明提供的间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：

(1)将根据上述保存方法冻存的脐带组织块立即置于39℃水浴中融化；

(2)加入包含1.5mol/L蔗糖的基础液，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.5mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.25mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.125mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；