[发明专利]一种间充质干细胞的保存方法和培养方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞的冻存液，该冻存液为包含50％(体积/体积)的胎牛血清、18.6％(体积/体积)的DMSO、15.4％(质量/体积)的乙酰胺、9.0％(体积/体积)的1，2-丙二醇、4.0％(质量/体积)的聚乙二醇的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

2.一种间充质干细胞的保存方法，该方法包括以下步骤：

(1)将脐带组织切割成块，置于体积比为1∶3的根据权利要求1所述的冻存液与基础液的混合溶液中预处理；

(2)将脐带组织块转移至体积比为1∶1的根据权利要求1所述的冻存液与基础液的混合溶液中，0℃下处理；

(3)将脐带组织块转移至根据权利要求1所述的冻存液中，0℃下处理；

(4)将脐带组织块在液氮中冻存，

其中所述基础液为包含50％(体积/体积)的胎牛血清的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

3.根据权利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述脐带组织块的体积小于2mm³。

4.根据权利要求2或3所述的保存方法，其特征在于，所述步骤(1)中的预处理时间为10～25分钟，例如15分钟；所述步骤(2)中的处理时间为5～15分钟，例如10分钟；所述步骤(3)中的处理时间为5～15分钟，例如10分钟。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的保存方法，其特征在于，所述冻存过程中脐带组织块与冻存液的质量体积比均为1∶4。

6.一种间充质干细胞的完全培养液，该完全培养液为包含10～20％(体积/体积)的胎牛血清，100U/mL的青霉素-链霉素，2ng/mL的两性霉素B，2～5mmol/L的L-谷氨酰胺和20mmol/L的羟乙基呱嗪乙硫磺酸的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

7.一种间充质干细胞的培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)将根据权利要求2至5中任一项所述的保存方法冻存的脐带组织块立即置于39℃水浴中融化；

(2)加入包含1.5mol/L蔗糖的基础液，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.5mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.25mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.125mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；

(3)在37℃下使沉淀的脐带组织块贴壁，加入根据权利要求6所述的完全培养液在37℃、100％湿度和5％(体积/体积)CO₂的条件下培养得到间充质干细胞，

其中所述基础液为包含50％(体积/体积)的胎牛血清的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的冻存的脐带组织块在水浴中经充分振荡快速升温融化。

9.根据权利要求7或8所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的平衡时间和离心时间均为5～10分钟，离心转速均为1800～2500转/分钟。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的脐带组织块与包含蔗糖的基础液的质量体积比均为1∶3。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的贴壁时间为10～90分钟。