[发明专利]获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法。

背景技术

自从1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外培养细胞技术以来，单层贴壁细胞培养技术 在科学研究中得到广泛应用，但是，生命科学领域的科学研究，关注的不仅仅是它们能否分 裂生长，更重要的是生长起来的细胞是否能代表体内的真实情况。目前在体外对于抗肿瘤药 物的筛选和治疗效果的研究，大多数都是用单层贴壁生长的二维生长模型，而这种生长方式 与体内组织细胞所真实存在的状态有很大差异，这种差异就造成了二维生长模型所得出的实 验结论与动物实验及临床实验的不符。所以用三维立体空间生长的细胞模型进行研究，能够 更好地模拟体内的真实状况，所得出的实验结论也更加客观、可信，值得将这种方法进行推 广，因此近年来体外实验中越来越多的学者开始关注三维生长实体瘤细胞的相关研究。但是 由于三维生长实体瘤细胞聚集成团，体外转染过程中团块内部的细胞很难接触到转染试剂， 导致转染效率不高、实验结果不稳定。因此，急需一种转染效率高、结果稳定可靠的对三维 生长实体瘤细胞进行体外基因转染的方法。

由于肝癌的发病率高，预后差，称为癌中之王，而且在国内由于肝炎病毒的感染，使得 肝癌在国内的研究价值及其重大等原因，所以我们选取了肝癌作为代表性的实体瘤进行研究， 研究结果将能够进行其它实体瘤的进一步推广应用。反义核酸治疗是一项非常成熟并且应用 广泛的技术，FDA已经批准多种基因的反义药物进入临床。所以应用反义核酸技术进行三维 生长模型转染方式的探索，将具有较高的学术意义和推广应用价值。由于肝癌的转移比肿瘤 本身具有更高的致死率和严重后果，并且肝癌的微转移难以检测和控制，所以选取能够控制 肿瘤转移的基因作为靶点具有更重大的意义。目前的研究显示，转移过程中的实体瘤也是聚 集成团、三维生长的，该技术可以推广应用到对于转移瘤的控制和治疗。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种可成功获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法， 本发明的方法为首先体外转染二维生长细胞，待转染过程结束再使其生长为三维细胞，即可 得体外基因转染成功了的三维生长实体瘤细胞。本方法转染效率高，结果稳定可靠。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，包括以下操作步骤：

1)取对数生长期单细胞悬液，用有血清培养液调整浓度为6×10⁵/ml，取2mL接种于25mL 培养瓶中，37℃培养20h；

2)在无菌EP管中混合反义寡核苷酸：取8μL PS-asODNs，加250μL Optim MEM，混 匀；

3)在另一支无菌EP管中混合脂质体：取10μL lipofectamine 2000，加250μL Optim MEM，混匀后室温放置5min；

4)取上述反义寡核苷酸混合物和lipofectamine 2000混合物，混合均匀，室温放置20min， 备用；

5)转染：采取以下两种方式之一进行转染：

取1)中的细胞，弃培养瓶中原来的培养液，加入2mL无血清培养液，继续培养6h后， 胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为4×10⁵/ml，500μL每孔加入到24孔板中， 孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞；

或：取1)中的细胞，继续培养6h后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度 为4×10⁵/ml，500μL每孔加入到24孔板中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后， 收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞。

所述有血清培养液优选含10％胎牛血清的RPMI1640，所述无血清培养液优选无血清 RPMI1640。

所述Poly-HEMA即为现有技术中已有的抗锚定培养板，其配制方法为：用20mL 95％的 乙醇溶解2.4g Poly-HEMA粉末，65℃振荡混匀8h以上，制备成Poly-HEMA储存液，于4℃ 密封保存。用时用95％的乙醇按1∶2.3的比例稀释成工作液，在无菌条件下将工作液沿孔壁 轻轻加入培养板孔的底部至覆盖整个孔底，然后在超净台中紫外线照射过夜，即制得 Poly-HEMA培养板，盖好盖子置于4℃，可保存一周，用前在紫外灯下照射0.5h，并用无菌 PBS洗涤3遍。