[发明专利]获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法

权利要求书

1.一种获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

1)取对数生长期单细胞悬液，用有血清培养液调整浓度为6×10⁵/ml，取2mL接种 于25mL培养瓶中，37℃培养20h；

2)在无菌EP管中混合反义寡核苷酸：取8μL100μmol/L的PS-asODNs，加250μL Optim MEM，混匀；

3)在另一支无菌EP管中混合脂质体：取10μL lipofectamine 2000，加250μL Optim MEM，混匀后室温放置5min；

4)取上述反义寡核苷酸混合物和lipofectamine 2000混合物，混合均匀，室温放置 20min，备用；

5)转染：采取以下两种方式之一进行转染：

取1)中的细胞，弃培养瓶中原来的培养液，加入2mL无血清培养液，然后将步骤4) 中制备的混合液加入到培养液中，继续培养6h后，胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液 调整浓度为4×10⁵/ml，500μL每孔加入到24孔板中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续 孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实体瘤细胞；

或：取1)中的细胞，将步骤4)中制备的混合液加入到培养液中，继续培养6h后， 胰蛋白酶消化细胞，用有血清培养液调整浓度为4×10⁵/ml，500μL每孔加入到24孔板 中，孔底预先铺有Poly-HEMA，继续孵育24h后，收集细胞，即得转染后的三维生长实 体瘤细胞；

所述预先铺有Poly-HEMA的24孔板的制备方法为：用20mL 95％的乙醇溶解2.4g Poly-HEMA粉末，65℃振荡混匀8h以上，制备成Poly-HEMA储存液，于4℃密封保存； 用95％的乙醇按1∶2.3的比例稀释成工作液，在无菌条件下将工作液沿孔壁轻轻加入培 养板孔的底部至覆盖整个孔底，然后在超净台中紫外线照射过夜，即得。

2.根据权利要求1所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于：所述有血清 培养液为含10％胎牛血清的RPMI1640，所述无血清培养液为无血清RPMI1640。

3.根据权利要求1所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于：转染后，进 行生物学活性检测，具体方案为：转染6h后消化细胞得到单细胞悬液，调整浓度为 3×10⁵/ml，100ul/每孔接种到96孔板，继续培养24h后，使用CCK-8试剂盒检测细胞生 物学活性。

4.根据权利要求3所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于：使用CCK-8 试剂盒检测细胞生物学活性的具体操作为：每孔细胞中加入CCK-8作用液10μL，继续培 养90min，于酶标仪450nm波长处测定OD值，计算细胞活性抑制率。

5.根据权利要求1所述的获取体外转染成功的实体瘤细胞的方法，其特征在于：转染后，检 测实体瘤细胞的死亡率，方案为：转染6h后消化细胞得到的单细胞悬液，调整浓度为 3×10⁵/ml，100ul/每孔接种96孔板，继续培养24h后，每孔加台盼蓝50ul，染色5min， 照相，然后用经胰蛋白酶消化成单个细胞后终止消化并镜下计数，计算细胞死亡率。