[发明专利]表达纯化猪α-干扰素的基因工程菌株构建

说明书

技术领域

本发明涉及表达猪α-干扰素的基因工程菌株的构建方法。更具体地说，本发明涉及采用内含肽介导的PHB系统在原核生物中表达和纯化得到猪α-干扰素的方法。

背景技术

干扰素具有广谱抗病毒作用，由多种氨基酸组成，在pH2～10时比较稳定，对热比较稳定，为干扰素制品的研制提供了良好的条件。在干扰素家族中，α-干扰素的抗病毒作用最为显著，是目前市场上的主流干扰素产品。利用基因工程技术研制重组干扰素是一条高效而经济的途径。随着动物保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种动物干扰素的研究成为近年来的研究热点。

目前，α-IFN常采用亲和纯化方式获得。

传统的亲和纯化方式是利用基因融合技术将亲和标签和目标蛋白进行融合表达质，再依靠亲和标签与固定化的配体之间的特异性吸附作用实现目标蛋白的分离纯化。通常情况下，通过亲和层析得到的融合蛋白，需再经过蛋白酶的水解作用移除亲和标签以得到纯化的目标蛋白质。在实验室规模的应用中，亲和纯化方式有着简单而方便的优点，但也存在着一些缺陷。一方面，为了消除亲和标签常常需要外加蛋白酶。尽管设计之初在融合标签与目的蛋白质之间引入了能够被蛋白酶特异性识别并切割的连接片段，但仍然存在着目标蛋白质被意外切割的情况；再者，后期对蛋白酶的清除过程以及蛋白酶本身较高的价格也增加了蛋白质纯化的成本。另一方面，亲和树脂及缓冲液的高制造成本也进一步加大了蛋白质纯化的代价，而在大规模的生产应用中，成本因素往往是必须考虑的一个重要方面。

因此，传统的亲和纯化技术由于受到上述两方面的限制，在大规模的工业生产中较难以发挥作用。如何降低蛋白质亲和纯化的成本也就成了人们研究的一个重要方向。而我们所采用的内含肽介导的新型蛋白质纯化方式正切合了这种需要。

内含肽是存在于前体蛋白中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来，同时将两端的蛋白质外显肽(extein)连接在一起，该过程即蛋白质剪接过程。内含肽以其独特的蛋白质剪接功能而被广泛应用于蛋白质工程领域，比如蛋白质的纯化、连接、环化等。其中，在蛋白质纯化方面，修饰后的内含肽能介导N-端或C-端单侧肽键断裂，与蛋白质亲和纯化技术联合应用，为重组表达的活性蛋白提供了良好的分离纯化途径，使传统的亲和层析技术有了重大突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的可用于表达猪α-干扰素的基因工程菌株，该菌株的构建方法，该菌株生产猪α-干扰素的方法；并且利用该菌株表达目的蛋白能够有效地降低生产成本。

本发明利用蛋白phasin与PHB特异结合的特性，将phasin、内含肽和目的蛋白融合表达；融合蛋白三联体phasin-内含肽-目的蛋白表达后，在工程菌株体内与PHB特异性结合；由于PHB颗粒重力较大，通过简单离心即可携带融合蛋白与杂质分离，除去杂质后，通过改变PHB亲和体的悬浮液温度、pH值，促使已经突变了的内含肽N末端不发生自动切割，C末端发生自动切割，释放目的蛋白至溶液，达到纯化目的蛋白的目标。

本发明的表达猪α干扰素基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：

1.通过定点突变PCR获得编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列；

2.将步骤1获得的基因序列连接在融合标签基因phasin和自切割蛋白基因intein的下游，构建表达质粒；

3.将表达质粒与编码亲和介质PHB的质粒共转化表达细菌BLR中。

4.将该菌株在改良的培养液(添加1.5～3.0％的乳酸钠的LB培养基，pH为6.8～7.5中培养16～24h，利用乳糖(终浓度0.1～10g/L)诱导基因工程菌株表达外源蛋白。在外源蛋白的表达过程中，诱导生成的三联体蛋白中phasin与PHB颗粒特异性地亲和，并且结合在一起。

5.冰浴中超声波破碎工程菌，离心分离PHB颗粒；大颗粒在一定浓度(20mM Tris-bispropane，50mM NaCl，1mM DTT，2mM EDTA)和pH值(6.0～6.5)的溶液中悬浮；逐步调节溶液的pH，并在一定温度下(20～25℃)诱导intein的C端特异断裂(时间为32h～72h)，释放猪α干扰素蛋白，达到同步表达和纯化。

本发明采用蛋白质自切割原件内含肽(intein)替代蛋白酶的作用，以细菌产生的内源性PHB颗粒替代亲和基质，从而有效的简化了纯化步骤、降低纯化蛋白的成本；是一种高效表达，自动切割，费用低廉的蛋白纯化体系，有利于蛋白大规模纯化。

生物材料保藏说明