[发明专利]表达纯化猪α-干扰素的基因工程菌株构建

权利要求书

1.一种在原核生物中表达猪α干扰素的方法，其特征在于构建的基因工程菌中同时实现猪α干扰素蛋白的表达和纯化。首先是通过定点突变PCR获得编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列，连接在融合标签基因phasin和自切割蛋白基因intein的下游，构建了表达质粒；将其与编码并累积的亲和介质PHB的质粒共转化表达细菌中；在改良的培养液中诱导表达，并诱导phasin蛋白与PHB颗粒亲和；分离亲和后的PHB颗粒并在一定条件下诱导内含肽intein的C端特异断裂，释放目标蛋白，从而达到表达和纯化同步。

2.根据权利要求1构建的一种工程菌株BLR(DE3)(pET-PPPIpIFN α+pJM9131)，该工程菌已提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC3439。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：这种菌株含有猪α干扰素蛋白基因，并能在原核生物中表达和纯化。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所含的重组表达载体是由以下元件构成：

1)猪α干扰素重组质粒；

2)质粒pET-PPPI；

3)质粒pJM9131。

5.一种用权利要求1-4所述的工程菌株生产猪α干扰素的方法，其特征在于：将获得的携带猪α干扰素的工程菌在改良LB培养液中，37℃，200rpm培养16h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续培养8h。将菌液移到离心管中，2～8℃，离心10min，弃去上清；沉淀加入Lysis buffer悬浮，低温超声破碎，2～8℃高速离心30min，收集沉淀；将沉淀悬浮于Wash buffer，低温高速离心30min，收集沉淀，重复2次；将不溶物悬浮于Cleavage buffer，低温高速离心30min，收集沉淀；将不溶物悬浮于Cleavage buffer，调整pH为6.5，20±2℃开始裂解，48h后，低温高速离心30min，收集上清；上清以三氯乙酸沉淀沉淀。所得上清液中含纯化后的猪α干扰素。

6.根据权利要求5所述的改良LB培养液，其特征在于：培养液中添加1.5～3.0％的乳酸钠，调整pH为6.8～7.5，添加Kan、Amp、Tet等抗生素至终浓度为1～50μg/mL。