[发明专利]一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是高山被孢霉发酵法生产花生四烯酸的领域，具体涉及获得一株高产量高山被孢霉的诱变筛选方法。

背景技术

花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)是属于ω-6系列的重要不饱和脂肪酸，是人体前列腺素合成的重要前体物质，也是人体中含量最高，分布最广的一种多不饱和脂肪酸。它在降血脂、抑制血小板聚集、抗炎症、抗癌、抗脂质氧化、促进脑组织发育等方面具有独特的生物活性，因此应用领域十分广泛，引起了人们极大的兴趣。花生四烯酸广泛而少量地存在于动物体和微生物中，目前，商业化花生四烯酸主要来源于动物脂质或深海鱼油。但是由于资源有限，而且所提取的产品中花生四烯酸含量很低，不仅产品质量不能满足人们的消费需求，而且成本一直居高不下，不适合于大规模生产，因而长期以来其研究和应用一直受到限制。利用微生物发酵法生产花生四烯酸由于具有不受原材料和气候限制、生产周期短、成本较低、产物含量高、分离提取容易等优点，已成为当前的研究热点。

花生四烯酸的生产菌种主要是霉菌，以被孢霉为最。一个好的菌种是发酵工业的核心，近年来，世界各国相继对菌种选育进行了研究。1987年Yamada等从土壤中分离得到多株AA产生菌，经自然选育获得一株高产菌Mortierella elongata IS-5，利用葡萄糖作碳源进行发酵生产，AA产量为4.3g/L。2000年，姚建铭等利用离子束注入生物技术对Mortierella alpine进行诱变，筛选得到一株高产菌，每升培养液可得生物量30.80g，干菌体油脂含量为25.8％，花生四烯酸的含量占总脂的45.37％。2004年，Eiji等MNNG诱变M.alpina 1S-4得到了ω-3脱氢酶活性低的突变株Y11，其AA产量可达到4.97g/L。2008年，赵沫等以轮梗霉紫外诱变突变株A1.13为出发菌株，制备其原生质体并连续采用紫外线、微波及硫酸二乙酯作为诱变剂进行多轮诱变，通过15℃低温和0.12g/mL乙酰水杨酸初筛及摇瓶发酵复筛，得到花生四烯酸产量提高的突变株MW40+DES20 II-4，其花生四烯酸占总脂肪酸的含量提高到15.098％。从国内外文献总结发现，目的都是为了提高花生四烯酸最终产量，但是很多菌种选育手段较繁琐，过程冗长，且较盲目，随机性较大，耗费了大量的人力和物力。

在本发明申请之前，也有一些关于花生四烯酸菌种选育相关专利的报道(公开号有CN1362522A，CN1587378A)。其中在CN1362522A中，以高山被孢霉为出发菌株，通过N+离子注入诱变，得到一株活性较好的诱变菌，经过发酵，生物量可达到30g/L，油脂10.8g/L，花生四烯酸产率4.65g/L，该专利缺点一方面是离子注入与霉菌相互作用的机理研究不够完善，另一方面是花生四烯酸产量较低，难以抵制外界同行竞争者带来的压力。公开号CN1587378A中，公开了一种花生四烯酸高产菌的分离筛选方法，效果明显，但这仅仅只是一种自然选育的过程，AA产量不能得到大幅度的提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易于实现的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路主要基于代谢途径的理性选育技术，通过对花生四烯酸生物合成代谢网络分析，选择了合适的筛选剂，选择筛选剂的出发点是通过对花生四烯酸合成代谢途径进行分析，对关键中间代谢产物进行调控来获得花生四烯酸产量较高的菌株。

具体的技术方案如下：

一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，包括如下步骤：

(1)种子的活化；

(2)种子的培养；

(3)种子液的预处理：

(3a)种子液经无菌生理盐水稀释、震荡、过滤后得到分散均匀的菌悬液；

(3b)将菌悬液中加入氯化锂，震荡处理1～6h；

(4)对步骤(3b)得到的种子处理液进行诱变；

(5)筛选：

(5a)初筛：将步骤(4)得到的诱变后的菌悬液涂布于含有EMP途径抑制剂和前列腺素合成酶抑制剂的平板上，挑出最先长出且直径较大的单菌落；

(5b)复筛：将挑出的单菌落转接斜面，待斜面长满后，再进行摇瓶培养，向种子液中加入红四氮唑染色剂，通过观察，挑选出变色时间最短、颜色最深的菌落；

(5c)再筛：将复筛挑出的种子液进行摇瓶发酵培养，以生物量、油脂产量、花生四烯酸产量为最终筛选指标，挑出花生四烯酸生长能力最强的菌株。