[发明专利]一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法

权利要求书

1.一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)种子的活化；

(2)种子的培养；

(3)种子液的预处理：

(3a)种子液经无菌生理盐水稀释、震荡、过滤后得到分散均匀的菌悬液；

(3b)将菌悬液中加入氯化锂，震荡处理1～6h；

(4)对步骤(3b)得到的种子处理液进行诱变；

(5)筛选：

(5a)初筛：将步骤(4)得到的诱变后的菌悬液涂布于含有EMP途径抑制剂和前列腺素合成酶抑制剂的平板上，挑出最先长出且直径较大的单菌落；

(5b)复筛：将挑出的单菌落转接斜面，待斜面长满后，再进行摇瓶培养，向种子液中加入红四氮唑染色剂，通过观察，挑选出变色时间最短、颜色最深的菌落；

(5c)再筛：将复筛挑出的种子液进行摇瓶发酵培养，以生物量、油脂产量、花生四烯酸产量为最终筛选指标，挑出花生四烯酸生长能力最强的菌株。

2.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(1)中，种子的活化方法为：将菌丝体接种于PDA斜面或添加了营养因子的PDA斜面25～28℃培养5～7天，其中，所述的营养因子为酵母膏、蛋白胨和牛肉膏中的任意一种或几种的混合物，营养因子的添加量为1～5g/L。

3.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(2)中，种子的培养方法为：活化好的菌丝体斜面用5～10mL的无菌水将菌丝体洗下来，然后将菌丝体接入摇瓶种子培养基中，接种量10～20％(v/v)，20～28℃培养48～72h，待种子生长至对数生长期。

4.根据权利要求3所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于所述的种子培养基配方为：葡萄糖20～60g/L，酵母膏3～6g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，硝酸钠2～5g/L，七水硫酸镁0.3～1g/L，其余为水，pH6.0～8.5。

5.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(3a)中，种子液接入已经灭菌处理过的铺有玻璃珠的凹槽三角瓶中，用体积为种子液的8～10倍、浓度为0.9g/100mL的无菌生理盐水稀释，25℃，250rpm震荡处理25～30min，用无菌的2～8层纱布或脱脂棉过滤，得到分散均匀的菌悬液。

6.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(3b)中，菌悬液加入装有体积与菌悬液相同、浓度为0.6～2.0g/100mL的氯化锂的生理盐水液的三角瓶中，将三角瓶置于震荡培养箱中20～28℃、转速100～150r/m处理1～6h。 

7.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(4)中，所述的诱变方法为紫外复合氯化锂诱变法，即将步骤(3b)得到的加入了氯化锂的菌悬液置于15～30W紫外灯下，照射距离20～35cm，照射时间为60～80s。

8.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(5a)中，所述的EMP途径抑制剂为碘乙酸，加入量为0.03～0.075g/L；所述的前列腺素合成酶抑制剂为乙酰水杨酸，加入量为0.1～0.4g/L。

9.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(5b)中，所述的红四氮唑染色剂为浓度为2～4g/L的红四氮唑水溶液，红四氮唑水溶液的加入体积与种子液体积比为1∶0.25～2。

10.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(5c)中，所述的发酵培养，其培养基配方为：葡萄糖60～150g/L，酵母膏5～12g/L，磷酸二氢钾2～6g/L，硝酸钠2～6g/L，七水硫酸镁0.5～1g/L，其余为水。