[发明专利]重金属Cu2+完全抗原及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明公开一种重金属Cu²⁺完全抗原及其制备方法，属于免疫学方法检测技术领 域。

背景技术：

目前已知有20多种重金属具有较大的毒性，其中铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、 铜(Cu)、铬、钴、镍、锡、钒等在农畜等产品中有不同程度的残留，对人类健康构成 严重威胁。因此，世界各国都十分重视环境和农产品重金属污染的控制和监测。传统 的重金属检测方法如：原子吸收光谱分析、电感耦合等离子发射光谱分析等需要大型 的昂贵的分析仪器，无法用于现场检测，难以适应环境及农畜产品的现场抽查及产品 进出口快速通关的要求。免疫学检测技术检测速度快、费用低、仪器简单易携、可用 于现场检验，对提高我国环境和农产品重金属控制和监测水平、保障农产品质量安全 和消费者的健康具有重要意义。

重金属免疫学检测方法建立的关键在于重金属特异性单克隆抗体的制备，而重金 属特异性单克隆抗体的制备的关键在于重金属完全抗原的制备。重金属离子的分子量 小(分子量＜1000)，自身不能作为有效的抗体识别目标，不能产生免疫反应。由于Cu²⁺的分子量约为64，分子量＜1000，并且Cu²⁺的螯合物在机体内很容易被分解代谢，不 能作为有效的抗体识别目标，不能刺激机体产生免疫反应。因此，Cu²⁺的完全抗原、 Cu²⁺特异性单克隆抗体及以此为基础的Cu²⁺免疫学检测方法尚未有报道。

发明内容：

本发明提供了一种重金属Cu²⁺完全抗原，可用于制备重金属Cu²⁺残留快速检测 ELISA试剂盒、胶体金免疫层析试纸及传感器。

本发明还公开了上述抗原的制备方法，整个制备过程无需特别的仪器设备、技术简 便可行、容易工厂化规模生产。

本发明的重金属Cu²⁺完全抗原，具有以下表证：

分子量70000～80000dal，紫外吸收峰值240nm～280nm，Cu²⁺含量达4.0 μg/mL～20.0μg/mL，电泳结果图见图1，紫外扫描结果见图2，Cu²⁺含量检测结果见表 1。

本发明重金属Cu²⁺完全抗原的制备方法，包括以下步骤：

取0.5～10mg水溶性铜盐溶于50μL超纯水，配制2.0～80mg/mL的Cu²⁺溶液；取 0.8～20mg双功能螯合剂溶于50μL二甲基亚砜，配制16～400mg/mL的ITCBE或 p-SCN-Bn-DOTA溶液；取2.0～20.0mg载体蛋白溶于1mL HEPES缓冲溶液或碳酸盐 缓冲液，配制2～20mg/mL的载体蛋白溶液；将配制的50μL 2.0～80mg/mL的Cu²⁺溶 液逐滴加入到50μL ITCBE或p-SCN-Bn-DOTA溶液中，于15～55℃、pH4.5～6.5、振 荡条件下反应15min～3h形成半抗原溶液；再将此半抗原溶液逐滴加入到1mL 2～20 mg/mL的载体蛋白溶液中，于4℃或室温、pH7.5～10.5条件下振荡反应24h；用超滤 或透析的方法去除未反应的低分子物质，得Cu²⁺的完全抗原。

所述的水溶性铜盐包括Cu(NO₃)₂或CuCl₂、CuSO₄、Cu(CH₃COO)₂、CuBr₂任意一 种。

所述的双功能螯合剂为：

1-(4-isothiocyanobenzyl)ethylenediamine N，N，N′，N′-tetraacetic acid(ITCBE)或

S-2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane tetraacetic acid (p-SCN-Bn-DOTA)。

所述的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白或卵清蛋白中的任意一种。