[发明专利]一种腈水合酶基因工程菌及应用

权利要求书

1.一种腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的基因工程菌株是紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)TH-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.2105。

2.利用权利要求1所述的腈水合酶基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，按照如下步骤进行：

(1)将在4℃保藏的腈水合酶基因工程菌株接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～250转/min的条件下培养32～56小时，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.75g/L，K₂HPO₄ 0.5～0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/L，pH7.5，其余为水；

(2)按照0.5～1.0％的体积百分比将步骤(1)的腈水合酶基因工程菌液接种到装有培养基的种子罐中，在28～30℃、摇床转速为200～300转/min的条件下培养32～48小时，得腈水合酶基因工程菌的种子液；所述的培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.75g/L，K₂HPO₄ 0.5～0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/L，pH7.5，其余为水；

(3)按照5.0～10.0％的体积百分比将步骤(2)所得种子液转接种到装有培养基的发酵罐中，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～48小时，得发酵液；所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素7.5～10.0g/L，KH₂PO₄ 0.5～1.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L，CoCl₂0.04～0.12mM，丙烯酰胺2～6mM，泡敌0.2～0.3g/L，pH 7.5～8.5，其余为水；

(4)将发酵液稀释为5～8g/L的菌液，然后用中空纤维微滤膜对收获的菌体进行微滤洗涤，清洗时采用正洗和反洗双向反复操作直至洗涤液的色度为5～20，蛋白质浓度为3～10ppm；正洗压力控制为0.06～0.1MPa，反洗压力控制为0.01～0.1MPa；再将菌液配成10～20g/L，体积分数5～8％，打入水合反应釜，调节丙烯腈流量至0.5～1.0m³/h，然后向水合釜内流加丙烯腈，流加速度从高向低逐步调小；反应釜夹套通-5～-9℃冷冻盐水或液氨，在16～26℃，pH6.7～7.5条件下进行水合反应1～3小时；接着用循环泵将水合液打入中空纤维超滤膜分离系统，用正洗和反洗方法反复操作滤去水合液中的细胞杂质和杂蛋白，直至 水合液的色度为5～15，蛋白质浓度为5～15ppm，得到丙烯酰胺水合液。