[发明专利]分离抑制链孢霉生长的细菌的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及食用菌栽培领域，具体地说，涉及一种分离得到对食用菌栽培有危害的链孢霉起抑制作用的细菌的方法。

背景技术：

链孢霉是一种顽强、速生的气生霉，主要危害各种食用菌菌种，也发生在栽培过程中，危害食用菌的菌丝体和子实体，极难防治，目前虽有化学药剂防治，但尚未发现能有效抑制链孢霉生长的微生物。

链孢霉广泛分布在自然界的土壤中、禾本科植物以及富含淀粉的食物上，能产生大量的分生孢子，靠气流传播。在培养室环境不卫生；或菌袋高压灭菌不彻底；或棉塞受潮、过松；或菌袋破漏，是链孢霉初侵染的主要途径。菌袋一旦受侵染后，所产生新的分生孢子，是再侵染的主要来源。在高温高湿条件下，能在1-2天内传遍整个培养室。

链孢霉是菌种生产期间危害最严重的一种病害。菌袋一经污染很难彻底清除，常引起整批菌种或菌袋报废，经济上损失很大。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种分离抑制链孢霉生长的细菌的方法，达到生物防治链孢霉的目的。

本发明的分离抑制链孢霉生长的细菌的方法，具体步骤为：

(1)采集样品：在培养室里，根据房间大小，3-5个方位取点；采集的样品于28℃培养箱培养3天；

(2)分离细菌：分离得到单株的纯的细菌；

(3)筛选拮抗细菌：在接种有链孢霉的培养基平皿上，分别划线待筛选菌；培养3天，若细菌和链孢霉之间存在拮抗线，则为能够抑制链孢霉生长的细菌。

分离到的细菌可以通过16srDNA分子鉴定得出其种属分类，具体方法为：提取抑制链孢霉的细菌基因组DNA后，PCR扩增，测序，比对，得出种属分类结果。

本发明的优点：安全，无毒，方便快捷，只需要从采集的样品中分离纯化出细菌，进而筛选出能抑制链孢霉生长的细菌即可。

具体实施方式

本发明的具体实施方案是这样实现的：

实施例1

(1)采集样品

全过程采取无菌操作，穿白大褂，戴口罩，手套一次性手套(尽量减少自身携带菌)，在培养室里，在东、西、南、北、中五个方位取点，每个点三个重复。将倒有约15mlLB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠10g，琼脂20g，调pH7.0-7.2，水1000ml，121℃灭菌20分钟)平皿打开静置于这些采样点5分钟，盖上皿盖，封口，于28℃培养箱培养3天。

(2)分离细菌

平皿中采集的细菌样品分类编号，用接种环划线于新的LB培养基平皿，于28℃培养箱培养3天，挑单菌落划线于新的LB平皿。如此重复分离三次，得到纯的细菌。

(3)筛选拮抗细菌

在LB培养基平皿中央接种链孢霉，于四周分别划线待筛选菌，分别作距离中央约1cm、2cm、3cm、不划线四个处理。培养3天后，观察细菌和链孢霉之间是否产生拮抗线，若有，则为能够抑制链孢霉生长的细菌。

最终发现3株细菌与链孢霉之间产生拮抗线。

16srDNA分子鉴定：提取基因组DNA后，PCR扩增，测序，比对，得出种属分类结果：

菌种1的种属分类为：

域：细菌

门：朊细菌

目：假单胞菌目

科：假单胞菌科

属：假单胞菌属

种：恶臭假单胞菌

命名：Pseudomonas putida lww-0709

菌种2的种属分类为：

域：细菌

门：朊细菌

目：假单胞菌目

科：假单胞菌科

属：假单胞菌属

种：恶臭假单胞菌

命名：Pseudomonas putida lww-1021

菌种3的种属分类为：

域：细菌

门：厚壁菌

纲：芽孢杆菌

目：芽孢杆菌

科：芽孢杆菌

属：芽孢杆菌

种：短小芽孢杆菌

命名：Bacillus pumilus lww-0709