[发明专利]一种用于重组工程的大肠杆菌菌株

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株用于重组工程的大肠杆菌。

背景技术

重组工程是指由重组酶催化的DNA短片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因 克隆或DNA改造的一种较为新颖的基因克隆手段。重组工程在常规基因克隆方法难以进行 或效率极低时有着极大的优势。例如当待克隆的DNA片段过大时，合适的酶切位点难以寻 找、凝胶回收难以进行、PCR扩增的得率低且易引入错配碱基；DNA片段经自外于照射等 操作也可能基因发生突变。重组工程则避免了这些操作步骤，已逐渐成为常规的克隆手段。

重组工程中的重组酶主要是来源自λ噬菌体三个基因，其中redα(exo)编码DNA5′端至 3′端的外切酶，其作用于双链DNA分子而产生3′端突出的分子；redβ(bet)编码单链结合蛋 白，其结合在DNA分子的3′突出端而防止大肠杆菌所产生的DNA内切酶RecBCD对外源 DNA的降解，同时还行使重组酶活性，即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；gam 基因的作用是抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解。这三个基因也就是通常意义上的 重组酶基因。

目前主要有两种重组工程系统，即两种重组酶存在和受诱导的形式。第一种是重组酶 基因克隆在质粒上的，如美国Purdue大学Barry Wanner教授实验室所构建的pKD46载体和 德国Dresden大学Youming Zhang博士等构建的pSC101-BAD-gbaA载体。这两个质粒的 共同点是：1.由redα，redβ和gam由pBAD启动子所驱动，pBAD启动子受L-阿拉伯糖诱 导表达的araC基因所激活。2.质粒的复制子为来源于pSC101的温度敏感性复制子，此复制 子在30℃行使复制功能，在37℃或更高温度时质粒不再复制而丢失。两个质粒的不同点 是：1.pKD46含有orf60a基因而pSC101-BAD-gbaA含有大肠杆菌来源的recA基因，这两 个基因都可以可促进同源重组的效率。常规的大肠杆菌的克隆宿主菌如DH10B是recA基 因缺陷型的以避免基因克隆中的异常重组。重组工程系统中的recA基因是瞬时诱导表达的， 故不会产生异常的重组。2.pKD46是氨苄青霉素抗性的，而pSC101-BAD-gbaA是四环素抗 性的。

第二种系统是美国国立癌症研究所Donald Court实验室构建的大肠杆菌DY380。DY380 中的redα，red和gam基因包含在缺陷前噬菌体中，此缺陷前噬菌体以整合至大肠杆菌基 因组的形式存在。redα，redβ和gam基因由PL启动子所诱导。32℃时，PL启动子被温度 敏感性抑制子cI857所抑制，42℃时抑制解除。因此在DY380中，重组酶的表达是由32℃ 转移至42℃时的热所诱导的。

这两个系统都有些缺点，首先它们均是在30℃时生长，而大肠杆菌的最适温度是37℃， 这样菌株的生长较慢；其次，含重组酶的质粒在重组发生后，在37℃下也不完全丢失，这 样就对重组克隆的分离带来困难。这常常需要将重组产物再次转化以去除含重组酶的质粒， 而这在进行细菌人工染色体(BAC)的操作时，会带来麻烦，因为BAC较大(其克隆片段可 达300kb)，反复转化(在多次修饰时)就可能对DNA有所伤害。对BAC的操作是重组工 程的优越点所在，也是经常要进行的。而整合型的DY380需要42℃水浴进行15分钟的热 诱导，这就增加了额外的操作，主要的是保持温度均匀有时难以控制。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株重组工程菌，该菌株是将重组酶基因(redα，redβ 和gam)以及相关的araC，pBAD，recA和庆大霉素抗性基因(Gm)一起在同源重组下，整 合至大肠杆菌DH10B的基因组上的endA基因区域而获得了。

大肠埃希氏菌CGMCC No.3192是通过以下方法获得：将行使重组工程的基因片段，即 包含来源于大肠杆菌的阿拉伯糖操纵元的调节基因araC，阿拉伯糖操纵元的启动子pBAD， 来源于λ噬菌体的重组酶基因redα、red β和gam，来源于大肠杆菌recA基因和庆大霉素抗 性基因(Gm)，一起整合至大肠杆菌DH10B的基因组中的endA基因区域而获得。其中redα， redβ，gam和recA由pBAD启动子所驱动。当在培养基中加入L-阿拉伯糖时，pBAD驱动 redα，redβ，gam和recA的表达，此时可催化DNA短片段之间的同源重组，即重组工程。 DNA短片段的长度一般在50个碱基对。