[发明专利]一种重组藻类体内生产生物柴油的方法

权利要求书

1.一种利用藻类油脂及其用于制备生物柴油的生物技术方法。其特征在于，包括藻类体内乙醇的制备和利用藻类体内油脂与乙醇发生酯交换反应制备体内生物柴油的方法，即使用了一种含有能表达丙酮酸脱羧酶(以下称之为PDC)活性和能表达乙醇脱氢酶(以下称之为ADH)活性的藻类，通过基因工程技术将一个能表达脂肪酸乙脂合成酶(以下称之为FAEES)活性的基因转入进去，在藻类体内表达的FAEES就能在一定的条件下催化藻类体内的乙醇与脂肪酸反应，体内得到生物柴油，副产物为甘油。

2.按权利要求一所述利用藻类油脂及其用于制备生物柴油的方法。其特征在于，所述利用藻类油脂及其用于制备生物柴油的步骤如下：

①.藻类生物体内乙醇的制备

1)基因克隆：由细菌中克隆pdc基因和Adh基因。由人肝脏细胞克隆FAEES基因。

2)质粒构建：将pdc和Adh分别连接到质粒pUC19中，得到pdc+pUC19和Adh+pUC19。制备大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌。

3)质粒扩增：在大肠杆菌中扩增质粒。提取质粒。

4)构建表达载体：酶切质粒pUC19，电泳，胶回收目的基因。再用酶切载体，得粘性末端。将pdc基因和Adh基因分别连接到质粒载体，得到pdc+载体和Adh+载体，FAEES+载体。

5)转化农杆菌：制备农杆菌感受态细胞，用上一步得到两种质粒转化农杆菌。

6)转染藻类：转化后的农杆菌与藻类共培养，使pdc基因和Adh基因，FAEE基因插入藻类基因组中。

7)基因表达：洗去农杆菌后，大量培养转基因藻类。

8)乙醇的检测。检测培养基中乙醇含量的变化。如果检测到乙醇明显增加，则说明以上两种基因已经成功转入藻类。

②.藻类生物油脂酯交换制备生物柴油

由人肝脏细胞克隆FAEES基因。以农杆菌为介质，再将FAEES基因转入上述转基因藻中。检测脂肪酸的含量变化。当含量不再变化时，破碎藻细胞经分离收集培养混合物，以催化工艺生产生物柴油，副产物为甘油。藻转化株的生物柴油体内生产和藻转化株的生物柴油体外生产。

3.按权利要求二所述生产的生物柴油技术。权利要求包括脂肪酸乙脂合成酶FAEES和脂肪酸甲脂合成酶FAMES，在生物柴油(脂肪酸乙脂和脂肪酸甲脂)的体内和体外生物合成应用。

4.按权利要求所述的藻类包括小球藻，微藻，常见的藻类和其他不常见藻类，淡水和咸水藻类。