[发明专利]杜氏藻耐高温高光突变株及其诱变选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)UTEX LB 999的耐高温高光的突变株，以及所述突变株的诱变选育方法。具体而言，本发明涉及两种杜氏藻耐高温高光突变株，一种是耐受42℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2(CGMCC No.2982)，另一种是耐受45℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4(CGMCC No.2983)。

背景技术

杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)隶属于绿藻门(Chlorophyta)、真绿藻纲(Chlorophyceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、杜氏藻科(Dunaliellaceae)，具有单细胞、无细胞壁、基因组小等特点。杜氏藻天然没有细胞壁，是迄今为止发现的少数极端耐盐的真核生物之一。杜氏藻富含β-胡萝卜素、维生素C、维生素E，油脂含量高，并且杜氏藻具有罕见的耐受极端高盐(可在饱和盐水中生存)、高温和高光强等极端生长环境的能力，生长条件相当粗放，因此成为人类主要的养殖藻类之一。据测算，杜氏藻室外全年养殖的平均生产率是平均20g干藻粉·m^-2·d^-1或0.25g胡萝卜素·m^-2·d^-1。因此美、澳、以、日等国已兴起大规模养殖杜氏藻提取胡萝卜素的产业，同时还可收获大量的蛋白质和甘油等副产物。

杜氏藻的最适生长温度为25～30℃，当温度超过35℃时，生长完全被抑制，藻细胞会逐渐死亡。而我国大部分地区夏季炎热高温，光照强度较高，常规的杜氏藻种难以耐受夏季高温和强光照，因此，杜氏藻难以在夏季实现大规模养殖。如果能通过诱变获得耐受高温及高光的藻株，将扩大该藻株的应用范围，对我国杜氏藻的养殖具有重要意义。

对于藻类的育种，目前普遍采用诱变育种法。诱变育种是指通过物理(射线照射等)和化学(诱变剂等)方法使藻类发生变异，从中选育出具有优良性状的藻种，是微藻育种中使用最多也是最有效的一种方法。诱变育种既能诱发基因突变，又能促进遗传基因重新组合，在短时间内获得大量  优良突变体作为新品种直接利用或作为种质资源间接利用，具有选择育种难以替代的优点。

常用的物理诱变辐射源有紫外线、倍频Nd:YAG激光、He-Ne激光、半导体激光、⁶⁰Co-γ射线、超声波等。紫外线是一种非电离辐射，可引起DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，从而导致基因突变。现有的研究已经通过紫外诱变的方法筛选获得了很多有应用价值的藻株。

然而，目前用于藻类育种的一些现有的诱变育种技术存在一些缺点：现有技术筛选时间较短，通常只经过一次筛选，得到的突变藻株遗传稳定性相对较差，容易出现回复突变；而且，现有技术一般只在室外进行高温高光暴晒，很容易受到天气因素的影响，实验的重复性较差。

发明内容

为了杜氏藻类的大规模培养，扩大其应用的目的，本发明人在寻找高效的、可操作的和重复性好的诱变育种筛选方法的同时，筛选得到稳定的耐高温高光的杜氏藻UTEX LB 999诱变株系，完成了本发明。本发明所用的野生株是UTEX LB 999，来源于UTEX The Culture of Alage(TheUniversity of Texas)。

因此，在第一方面中，本发明的一个目的在于针对常规的杜氏藻无法耐受高温的缺陷以及常规选育方法的缺陷，提供一种采用紫外线诱变选育杜氏藻的耐受高温高光突变株的方法。

所述方法包括下列步骤：

(1)将处于对数生长期的杜氏藻进行紫外诱变后，无光暗培养；

(2)取步骤(1)的诱变藻株培养液，在室外高温高光条件下进行预备高温高光处理，筛选存活的单个藻株；

(3)将步骤(2)的单个藻株进行高温高光的初步筛选；和

(4)将步骤(3)筛选得到的单个藻株进行高温高光复筛。

在本发明的一个实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(1)的紫外诱变用2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离藻液30cm，照射75s。但是，本领域技术人员应该理解，可以根据本领域公知常识适当选择紫外诱变所用的紫外线波长/频率、紫外光源距离藻液的距离、紫外照射的时间、紫外线照射量等参数。