[发明专利]一种甲基苯丙胺的胶体金标记免疫检测垫、试纸及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外快速免疫检测工具及其使用方法，具体涉及一种甲基苯丙胺的多梯度胶体金标记检测垫、试纸及其免疫检测方法。

背景技术

甲基苯丙胺(又名去氧麻黄碱或安非他命)呈白色结晶体或粉末状，俗称冰毒。甲基苯丙胺为中枢兴奋剂，能抑制丁氨基氧化酶的活性，使肾上腺素和肾上腺素能神经的化学传导物质-去甲基肾上腺素的破坏减慢，大脑皮质以及皮质下中枢产生兴奋，具有欣快、警觉及抑制食欲的作用。滥用者会处于强烈兴奋状态，表现为不吃不睡、活动过度、情感冲动、偏执狂、妄想、幻觉和暴力倾向。为了捕捉和感受一种短暂即逝的强烈快感或兴奋，避免快感过后的失落、抑郁、疲劳感，常常导致强迫性用药行为。因而极易成瘾。甲基苯丙胺是目前国际、国内蔓延最广，流行最快的毒品之一。

甲基苯丙胺可以使用多种方法进行检测，如气相色谱(GC)气相色谱/质谱(GC/MS)，高效液相色谱(HPLC)等。但是费用较高，所需的时间较长。因此目前在进行毒品筛查过程中更多使用的是免疫胶体金检测方法。

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金在弱碱环境下带负电荷，胶体金标记，实质上是蛋白质等带正电荷基团的高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质等被吸附物质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。

目前毒品检测中使用的免疫胶体金检测方法原理为将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显示出来。样本中的被检测成分在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体与硝酸纤维素(NC)膜检测线上被检测成分-BSA偶联物的结合，使检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显色，结果为阴性。

在胶体金免疫检测法中，可使用的胶体金通常是红色型或紫红色型。

下面以目前普遍使用的甲基苯丙胺胶体金标记免疫检测方法为例进行说明。

(1)免疫原的制备：采用活化脂法，将牛血清白蛋白(BSA)与甲基苯丙胺结合，制成甲基苯丙胺的免疫原。

(2)抗甲基苯丙胺的特异抗体的制备：将制备的甲基苯丙胺合成免疫原免疫小鼠，提取小鼠腹水，分离纯化以得到抗甲基苯丙胺单克隆抗体。

(3)胶体金的制备：采用还原法制备胶体金，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。

(4)胶体金标记抗甲基苯丙胺的特异抗体的制备：将特异抗体加入到胶体金溶液中混合，获得胶体金标记的抗体。

(5)抗胶体金标记抗体的二抗的制备：采用常规的制备方法制备二抗。

(6)硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜的处理

硝酸纤维膜的包被：硝酸纤维膜作为检测过程中的抗原抗体反应的载体，要依次包被甲基苯丙胺-BSA结合物(测试线即T线)和抗胶体金标记抗体的二抗(质控线即C线)。

玻璃纤维膜处理：将检测阈值为1000ng/mL的冻干的胶体金标记的抗甲基苯丙胺的特异抗体固定于玻璃纤维膜，制成胶体金垫。

(7)免疫层析试纸条的制备

在塑料底板7上分别将吸液用玻璃纤维6、固着冻干胶体金标记的抗甲基苯丙胺的特异抗体的玻璃纤维膜金标垫5、包被甲基苯丙胺-BSA结合物和抗胶体金标记抗体的二抗的硝酸纤维素膜2和吸水垫1依次粘贴，如图1所示，其中硝酸纤维素膜2两端分别与吸水垫和抗甲基苯丙胺单抗金标垫5互相交叠连接，在抗甲基苯丙胺单抗金标垫5上压有玻璃纤维6。

(8)样品测试和结果判断方法