[发明专利]对虾白斑综合症病毒极早期基因启动子及其克隆方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的对虾白斑综合症病毒极早期基因启动子及其克隆方法，以及含有上述启动子的表达载体，可用于在宿主细胞中表达外源基因，属于基因工程领域。

背景技术

在基因工程领域中，目标基因的重组表达不论在理论研究还是在实际应用上都具有重要的意义。要使目标基因在宿主细胞中表达，就要将它克隆到带有基因表达所需要的各种元件的基因工程载体中，这种载体就称为表达载体。对不同的表达系统，需要采用不同的表达载体。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，能够方便且高效地表达、纯化重组蛋白，但是当目标基因是真核基因时，原核系统就表现出许多缺陷：如没有真核细胞翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和正确的空间构像，因而产生的蛋白质常缺乏良好的生物学活性；而且重组蛋白常常以包涵体形式存在，复性困难。这种情况下就需要使用真核表达系统来表达目标基因(1、楼士林，杨盛昌，龙敏南，章军，基因工程，北京：科学出版社，2002年，第一版)。

常用的真核表达系统有酵母、昆虫、哺乳类细胞以及植物等表达系统。真核表达载体需要具备一些基本元件，包括在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件：真核启动子、转录终止信号、poly-A加尾信号、mRNA剪接信号、筛选标志基因以及供外源基因插入的多克隆位点等。此外，还需要在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、筛选标志等，以便能在大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆(1、楼士林，杨盛昌，龙敏南，章军，基因工程，北京：科学出版社，2002年，第一版；2、萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂译，分子克隆实验指南，北京：科学出版社，2002年，第三版)。

真核启动子作为在真核细胞中启动基因转录的必需元件，是真核表达载体中一个关键的组成部分，它决定了目标基因的表达效果。启动子通常具有一定的种属或者组织特异性，其活性还有强弱之分。目前已经有许多不同性质的启动子被成功地应用在基因工程领域中，它们通常来源于病毒、酵母、藻类、植物、动物的基因组。其中病毒是一类侵染性极强的微小寄生生物，它在侵入细胞之后需要利用宿主的细胞机器来表达自身的基因(3、Alan J.Cann.Principles of Molecμlar Virology.4^th edition)。来源于病毒的启动子，特别是来源于DNA病毒的启动子以其强活性在动物细胞表达系统中占有至关重要的位置。DNA病毒的基因根据其表达的时间可划分为极早期基因、早期基因和晚期基因。病毒入侵宿主的最初阶段，在无新病毒蛋白合成的情况下，一些病毒基因的启动子可以被宿主细胞中的转录调节因子识别，并利用宿主细胞RNA多聚酶II进行转录，这些基因称为病毒极早期基因(4、Buisson，M.，Manet，E.，Trescol-Biemont，M.C.，Gruffat，H.，Durand，B.，and Sergeant，A.(1989).The Epstein-Barrvirus(EBV)early protein EB2 is a posttranscriptional activator expressed under the control of EBVtranscription factors EB1 and R.J Virol 63(12)，5276-5284)。而病毒早期基因和晚期基因的转录则需要利用病毒极早期基因的表达产物。病毒极早期基因通常编码了控制病毒增殖的重要调控因子，不仅负责调节病毒后续的基因表达(包括早期基因和晚期基因)，而且能够通过转录调控或者其他方式改变宿主细胞的生理和免疫状态，使之有利于病毒生命周期的进行(5、Holley-Guthrie，E.A.，Quinlivan，E.B.，Mar，E.C.，and Kenney，S.(1990).The Epstein-Barr virus(EBV)BMRF1 promoter for early antigen(EA-D)is regμlated by the EBV transactivators，BRLF1and BZLF1，in a cell-specific manner.J Virol 64(8)，3753-3759；6、Kenney，S.，Holley-Guthrie，E.，Mar，E.C.，and Smith，M.(1989).The Epstein-Barr virus BMLF1promoter contains an enhancerelement that is responsive to the BZLF1 and BRLF1 transactivators.J Virol 63(9)，3878-3883)。由于病毒极早期基因的转录完全依赖宿主细胞来完成，因此通常情况下这类基因的启动子是能够作为表达载体的元件在宿主细胞中启动下游基因表达的。例如来源于巨细胞病毒CMV的极早期启动子以及来源于猴空泡病毒SV40的早期启动子，是目前商业化的哺乳动物表达载体中最常用的强启动子，例如Clontech公司以及Sigma公司的pCMV系列载体，Invitrogen公司的pcDNA系列载体；而来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)极早期启动子以及黄杉毒蛾核型多角体病毒(OpNPV)极早期启动子，是昆虫表达载体中常用的启动子，例如Novagen公司pIEx系列载体，以及Invitrogen公司的pIZ/V5-His载体。由此可见，DNA病毒的极早期基因是强启动子的良好来源。