[发明专利]一种重组人促红素分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程重组蛋白纯化领域，尤其涉及一种采用阴离子交换层析技术对重组人促红素进行分离纯化的方法。

背景技术

促红素(Erythropoietin，EPO)最早发现于1906年，是一种糖蛋白，属唾液糖蛋白激素，蛋白质部分由166个氨基酸组成，分子量为34KD。其编码基因是单拷贝基因，定位于人的7号染色体长臂21区。依据其糖型结构的差异可分为α、β两种，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物，两种类型在生物学特性、抗原性等效果上均相同。促红素的生理作用是刺激骨髓中血红蛋白或红细胞的形成，主要由肾脏生成并通过循环血进入骨髓而发挥作用。当人的肾功能发生严重损害时，如在急、慢性肾衰竭或肾切除的情况下，EPO的产生减少，出现贫血。因此，EPO对绝大多数肾性贫血患者均有很好的疗效。

1985年，人EPO基因克隆和表达的成功使重组人促红素的制备成为现实，重组人促红素(rhEPO)采用反转录PCR技术克隆人EPO-cDNA，将其插入到真核细胞表达载体中，构建重组表达质粒，并转化到CHO细胞中，筛选出高效稳定表达人EPO的工程细胞株。培养该工程细胞，收获上清，进行rhEPO蛋白分离纯化。rhEPO具有与天然的人促红素相同的结构及生理作用，是治疗肾性贫血的首选药物，还可用于外科围手术期的红细胞动员，治疗癌症及癌症放疗化疗引起的贫血，治疗艾滋病伴发贫血症等，rhEPO是目前为止人类开发最成功的基因工程药物。随着对rhEPO临床应用的深入研究，发现rhEPO在治疗妇科贫血、孕产妇贫血、类风湿性关节炎所致的贫血等方面都有较好的效果。

目前已有重组人促红素分离纯化方法具有以下缺点：操作繁琐，每次处理量不高，工艺放大难度大，不适合大规模生产，且最终rhEPO纯度仅能达到95％以上，唾液酸含量为9.0mol/molEPO以上，体内生物学比活性为1.2×10⁵IU/mg。

亟需建立一种适合大规模生产且生产成本低的重组人促红素(rhEPO)分离纯化方法，以满足大量患者的需求。

发明内容

为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种工艺稳定、容易放大、适合大规模生产且生产成本低的重组人促红素分离纯化方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种重组人促红素分离纯化方法，包括以下步骤：

1)样品进行蓝胶层析；

2)所述蓝胶层析产物进行超滤浓缩；

3)所述超滤浓缩产物进行离子交换层析I，用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用pH6.5～7.5，含0.03～0.07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱至基线，再用pH6.5～7.5，含0.08～0.15mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱；

4)所述离子交换层析I产物进行C4反相层析；

5)所述C4反向层析产物进行离子交换层析II，用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，上样后先用pH3.7～4.7、含4～8mol/L尿素、0.5～2mmol/L甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至基线后再用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗10～15个柱体积，最后用pH6.5～7.5、含0.1～0.4mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱；

6)所述离子交换层析II产物进行S-200分子筛层析，得到重组人促红素蛋白。

所述步骤1)中样品为灌流培养细胞收集液；

所述步骤1)具体为：用pH6.5～7.5、含0.1～0.3mo l/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，上样后，先用所述缓冲液平衡液淋洗至基线，再用pH6.5～7.5、含1.0～1.4mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集rhEPO峰。

优选地，步骤1)具体为：用pH7.0、含0.2mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl缓冲液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，上样后，先用所述缓冲液平衡液淋洗至基线，再用pH7.0、含1.3mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集rhEPO峰。