[发明专利]一种重组人促红素分离纯化方法

权利要求书

1.一种重组人促红素分离纯化方法，包括以下步骤：

1)对样品进行蓝胶层析；

2)对所述蓝胶层析产物进行超滤浓缩；

3)对所述超滤浓缩产物进行离子交换层析I，用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用pH6.5～7.5、含0.03～0.07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱至基线，再用pH6.5～7.5，含0.08～0.15mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱；

4)对所述离子交换层析I产物进行C4反相层析；

5)对所述C4反向层析产物进行离子交换层析II，用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用pH3.7～4.7、含4～8mol/L尿素、0.5～2mmol/L甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至基线后再用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗10～15个柱体积，最后用pH6.5～7.5、含0.1～0.4mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱；

6)对所述离子交换层析II产物进行S-200分子筛层析，得到重组人促红素蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中的所述样品为灌流培养细胞收集液。

3.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤1)具体为：用pH6.5～7.5、含0.1～0.3mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl缓冲液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，上样后，先用所述缓冲液平衡液淋洗至基线，再用pH6.5～7.5、含1.0～1.4mol/LNaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集rhEPO峰。

4.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤2)具体为：用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液进行超滤浓缩，浓缩至浓缩液电导率和缓冲液电导率相差100～200μS/cm。

5.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤3)具体为，用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用pH6.5～7.5、含0.03～0.07mol/L NaCl的10mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱至基线，再用pH6.5～7.5，含0.08～0.15mol/LNaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集DEAE I洗脱峰。

6.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤4)具体为：用pH6.5～7.5、含4％～10％乙醇的10mmol/LTris-HCl缓冲液平衡C4柱，上样后，先用pH6.5～7.5、含4％～10％乙醇的10mmol/LTris-HCl缓冲液淋洗至基线，再用pH6.5～7.5、含40％～70％乙醇的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰。

7.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤5)具体为：

用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用pH3.7～4.7、含4～8mol/L尿素、0.5～2mmol/L甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至基线后再用pH6.5～7.5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗10～15个柱体积，最后用pH6.5～7.5、含0.1～0.4mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集DEAE II洗脱峰。

8.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，所述步骤6)具体为：用pH6.0～8.0、含50～150mmol/L NaCl的20mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液平衡S-200柱，上样并洗脱，同时用0.22μm过滤器过滤并无菌收集，收集峰即为重组人促红素。